| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩略语表 | 第8-14页 |
| 综述 | 第14-23页 |
| 1. 胸膜肺炎放线杆菌的研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1 病原学及流行病学 | 第14-15页 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的防治 | 第15页 |
| 1.3 APP与宿主的相互作用 | 第15-19页 |
| 2. 细菌HtrA蛋白研究进展 | 第19-21页 |
| 2.1 细菌HtrA蛋白的概述 | 第19页 |
| 2.2 细菌HtrA蛋白的结构 | 第19-20页 |
| 2.3 细菌HtrA蛋白的功能 | 第20-21页 |
| 2.4 细菌HtrA蛋白的免疫特性 | 第21页 |
| 3. 基于质谱技术的蛋白质研究 | 第21-23页 |
| 研究目的意义 | 第23-24页 |
| 第一章 胸膜肺炎放线杆菌HtrA的克隆及表达 | 第24-42页 |
| 1 材料 | 第24-26页 |
| 1.1 实验菌株与质粒 | 第24页 |
| 1.2 主要试剂 | 第24-25页 |
| 1.3 培养基及试剂的配制 | 第25页 |
| 1.4 主要仪器 | 第25-26页 |
| 2 方法 | 第26-31页 |
| 2.1 htrA基因引物的设计 | 第26页 |
| 2.2 APP基因组DNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.3 目的基因扩增 | 第27页 |
| 2.4 重组质粒pMD19-T-htrA的构建 | 第27-29页 |
| 2.5 原核表达载体pET22b-htrA的构建 | 第29页 |
| 2.6 重组蛋白的初步表达鉴定 | 第29页 |
| 2.7 重组蛋白免疫印迹分析 | 第29-30页 |
| 2.8 重组菌的大量诱导表达 | 第30页 |
| 2.9 HtrA蛋白的Ni-NTA提纯 | 第30页 |
| 2.10 HtrA的生物信息学分析 | 第30-31页 |
| 3 结果 | 第31-39页 |
| 3.1 目的片段的扩增 | 第31-32页 |
| 3.2 重组表达质粒的酶切鉴定 | 第32页 |
| 3.3 htrA基因的比对分析 | 第32-33页 |
| 3.4 SDS-PAGE检测重组表达蛋白 | 第33页 |
| 3.5 HtrA蛋白免疫印记检测 | 第33-34页 |
| 3.6 重组蛋白纯化结果 | 第34-35页 |
| 3.7 纯化的重组蛋白定量结果 | 第35-36页 |
| 3.8 HtrA蛋白的生物信息学分析 | 第36-39页 |
| 3.8.1 HtrA重组蛋白可溶性预测 | 第36页 |
| 3.8.2 HtrA蛋白的二级结构分析 | 第36页 |
| 3.8.3 HtrA蛋白三级结构构建及保守域分析 | 第36-37页 |
| 3.8.4 HtrA蛋白的功能位点分析 | 第37页 |
| 3.8.5 HtrA抗原表位分析 | 第37-38页 |
| 3.8.6 HtrA互作蛋白预测 | 第38-39页 |
| 3.8.7 htrA基因的多序列比对分析 | 第39页 |
| 4 分析讨论 | 第39-41页 |
| 4.1 关于htrA基因的克隆与表达 | 第39-40页 |
| 4.2 关于HtrA的生物信息学分析 | 第40-41页 |
| 5 小结 | 第41-42页 |
| 第二章 APP HtrA的蛋白酶切、分子伴侣功能及其免疫特性研究 | 第42-62页 |
| 1 材料 | 第42-43页 |
| 1.1 实验菌株与质粒 | 第42页 |
| 1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 1.3 培养基及试剂的配制 | 第42-43页 |
| 1.4 实验仪器与耗材 | 第43页 |
| 1.5 实验动物 | 第43页 |
| 2 方法 | 第43-48页 |
| 2.1 蛋白酶切活性分析 | 第43-44页 |
| 2.2 HtrA在APP菌体内作用底物的鉴定 | 第44-45页 |
| 2.2.1 原核表达载体pET28a-ompP5的构建 | 第44页 |
| 2.2.2 OmpP5蛋白的体外诱导表达与分离纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.3 rHtrA体外降解OmpP5 | 第45页 |
| 2.3 HtrA与猪肺组织的相互作用 | 第45-46页 |
| 2.3.1 肺组织蛋白的提取 | 第45-46页 |
| 2.3.2 HtrA与肺组织互作蛋白的筛选 | 第46页 |
| 2.3.3 HtrA降解Hsp90的免疫印迹鉴定 | 第46页 |
| 2.4 分子伴侣活性试验 | 第46页 |
| 2.5 HtrA蛋白的免疫特性 | 第46-48页 |
| 2.5.1 IgG抗体水平的检测 | 第46-47页 |
| 2.5.2 淋巴细胞增殖试验 | 第47-48页 |
| 2.5.3 抗血清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ测定 | 第48页 |
| 2.5.4 免疫保护性研究 | 第48页 |
| 3 结果 | 第48-58页 |
| 3.1 蛋白酶切活性分析结果 | 第48-49页 |
| 3.2 HtrA在APP菌体内作用底物的鉴定 | 第49-52页 |
| 3.2.1 重组表达质粒酶切鉴定 | 第49-51页 |
| 3.2.2 ompP5基因的比对分析 | 第51页 |
| 3.2.3 重组蛋白rOmpP5的表达与纯化结果 | 第51-52页 |
| 3.2.4 rHtrA体外降解OmpP5鉴定 | 第52页 |
| 3.3 HtrA与猪肺组织的相互作用结果 | 第52-54页 |
| 3.3.1 HtrA与肺组织互作蛋白的筛选结果 | 第52-53页 |
| 3.3.2 HtrA降解Hsp90的免疫印迹鉴定 | 第53-54页 |
| 3.4 HtrA的分子伴侣活性 | 第54-55页 |
| 3.5 鼠抗rHtrA、L20血清的IgG抗体水平测定 | 第55页 |
| 3.6 IgG1和IgG2a的测定结果 | 第55-56页 |
| 3.7 抗血清中细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ测定 | 第56-57页 |
| 3.8 淋巴细胞增殖结果 | 第57页 |
| 3.9 rHtrA蛋白的免疫保护性研究 | 第57-58页 |
| 4 分析讨论 | 第58-61页 |
| 4.1 关于HtrA蛋白功能 | 第58-59页 |
| 4.2 关于HtrA蛋白免疫特性 | 第59-61页 |
| 5 小结 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-78页 |
