| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-33页 |
| 1.1 谷胱甘肽的性质及其生产方法 | 第15-19页 |
| 1.1.1 谷胱甘肽简介——主要性质及其用途 | 第15-17页 |
| 1.1.2 谷胱甘肽的生产方法 | 第17-19页 |
| 1.1.2.1 萃取法 | 第17页 |
| 1.1.2.2 化学合成法 | 第17页 |
| 1.1.2.3 发酵法 | 第17-18页 |
| 1.1.2.4 酶法 | 第18-19页 |
| 1.2 谷胱甘肽的生物合成途径 | 第19-21页 |
| 1.2.1 标准途径 | 第19页 |
| 1.2.2 双功能酶途径 | 第19页 |
| 1.2.3 替代途径 | 第19-20页 |
| 1.2.4 其它途径 | 第20-21页 |
| 1.3 谷胱甘肽双功能酶GSHF | 第21-22页 |
| 1.3.1 谷胱甘肽双功能酶GshF的结构 | 第21页 |
| 1.3.2 谷胱甘肽双功能酶的研究背景 | 第21-22页 |
| 1.4 ATP再生体系 | 第22-24页 |
| 1.5 多酶反应 | 第24-26页 |
| 1.5.1 多酶反应简述 | 第24-25页 |
| 1.5.2 多酶反应体系的分类 | 第25页 |
| 1.5.3 多酶反应的应用 | 第25-26页 |
| 1.6 多酶共固定化 | 第26-30页 |
| 1.6.1 有载体共固定化 | 第27-28页 |
| 1.6.1.1 共价固定法 | 第27页 |
| 1.6.1.2 物理包埋法 | 第27-28页 |
| 1.6.1.3 吸附法 | 第28页 |
| 1.6.2 微通道上的连续固定化 | 第28-29页 |
| 1.6.3 DNA支架定向固定化多酶 | 第29页 |
| 1.6.4 其他多酶位点特异性共固定化技术 | 第29-30页 |
| 1.7 体外多酶催化体系 | 第30-31页 |
| 1.7.1 蛋白融合技术 | 第30-31页 |
| 1.7.2 支架技术 | 第31页 |
| 1.7.3 共固定化技术 | 第31页 |
| 1.8 本论文的研究内容与目的 | 第31-33页 |
| 第二章 PGD、PAD、PPD和PDCCCC重组菌株的构建 | 第33-45页 |
| 2.1 材料与方法 | 第33-40页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第33-34页 |
| 2.1.2 主要生物试剂 | 第34-35页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第35页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第35-36页 |
| 2.1.6 引物设计 | 第36-37页 |
| 2.1.7 表达载体的构建 | 第37-40页 |
| 2.1.7.1 表达载体pET28a-GshF-Doc1-1Ⅰ-1的构建 | 第37页 |
| 2.1.7.2 表达载体pET28a-ADK-DocⅡ的构建 | 第37-38页 |
| 2.1.7.3 表达载体pET28a-PAP-Doc1-3的构建 | 第38-39页 |
| 2.1.7.4 表达载体pETDuet-1-Coh1-1-CohⅡ-CBD-Coh1-3的构建 | 第39-40页 |
| 2.2 结果与分析 | 第40-44页 |
| 2.3 小结与讨论 | 第44-45页 |
| 第三章 重组菌PGD的诱导表达及GSHF-DOC1-1酶学性质分析 | 第45-60页 |
| 3.1 材料与方法 | 第45-51页 |
| 3.1.1 主要试剂与仪器 | 第45-47页 |
| 3.1.1.1 主要化学试剂 | 第45-46页 |
| 3.1.1.2 主要仪器 | 第46页 |
| 3.1.1.3 培养基与培养条件 | 第46-47页 |
| 3.1.1.4 蛋白亲和纯化试剂 | 第47页 |
| 3.1.2 实验方法 | 第47-51页 |
| 3.1.2.1 重组菌的诱导表达 | 第47页 |
| 3.1.2.1 大肠杆菌菌浓度的测定 | 第47页 |
| 3.1.2.2 大肠杆菌细胞超声破碎 | 第47-48页 |
| 3.1.2.3 蛋白浓度测定 | 第48页 |
| 3.1.2.4 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第48-49页 |
| 3.1.2.5 蛋白纯化 | 第49页 |
| 3.1.2.5 脱盐 | 第49页 |
| 3.1.2.6 谷胱甘肽的检测 | 第49-50页 |
| 3.1.2.7 谷胱甘肽双功能酶酶活测定 | 第50页 |
| 3.1.2.8 GshF-Doc1-1催化合成GSH体系 | 第50-51页 |
| 3.2 结果与讨论 | 第51-58页 |
| 3.2.1 重组菌PGD的表达 | 第51页 |
| 3.2.2 GshF-Doc1-1表达条件的优化 | 第51-53页 |
| 3.2.3 GshF-Doc1-1蛋白的纯化 | 第53-54页 |
| 3.2.4 酶学性质研究 | 第54-57页 |
| 3.2.5 利用GshF-Doc1-1体外催化合成谷胱甘肽 | 第57-58页 |
| 3.3 小结 | 第58-60页 |
| 第四章 重组菌PAD、PPD的诱导表达的及其酶学性质研究 | 第60-73页 |
| 4.1 材料与方法 | 第60-63页 |
| 4.1.1 主要试剂与仪器 | 第60页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第60-63页 |
| 4.1.2.1 重组菌的诱导表达、蛋白浓度测定、蛋白电泳、酶的纯化 | 第60页 |
| 4.1.2.2 ATP、ADP、AMP含量分析 | 第60-62页 |
| 4.1.2.3 ADK-DocⅡ、PAP-Doc1-3酶活的测定 | 第62-63页 |
| 4.1.2.4 ADK-DocⅡ、PAP-Doc1-3酶学性质分析 | 第63页 |
| 4.2 结果与讨论 | 第63-71页 |
| 4.2.1 腺苷酸激酶ADK-DocⅡ的表达 | 第63-64页 |
| 4.2.2 腺苷酸激酶ADK-DocⅡ亲和纯化 | 第64-65页 |
| 4.2.3 多磷酸AMP磷酸转移酶PAP-Doc1-3的表达 | 第65-66页 |
| 4.2.4 多磷酸AMP磷酸转移酶PAP-Doc1-3亲和纯化 | 第66-67页 |
| 4.2.5 腺苷激酶ADK-DocⅡ的酶活测定 | 第67页 |
| 4.2.6 腺苷激酶ADK-DocⅡ的酶学性质研究 | 第67-68页 |
| 4.2.7 多磷酸AMP磷酸转移酶PAP-Doc1-3的酶活测定 | 第68-69页 |
| 4.2.8 多磷酸AMP磷酸转移酶PAP-Doc1-3的酶学性质研究 | 第69-71页 |
| 4.2.9 ADK-DocⅡ和PAP-Doc1-3偶联的ATP再生系统效率研究 | 第71页 |
| 4.3 小结 | 第71-73页 |
| 第五章 体外多酶组装催化合成谷胱甘肽 | 第73-78页 |
| 5.1 材料与方法 | 第73-74页 |
| 5.1.1 主要试剂与仪器 | 第73页 |
| 5.1.2 蛋白支架的诱导表达 | 第73页 |
| 5.1.3 蛋白支架组装ADK-DocⅡ、PAP-Doc1-3与GshF-Doc1-1用于谷胱甘肽的合成 | 第73-74页 |
| 5.1.4 反应体系中ATP、ADP、AMP浓度的测定 | 第74页 |
| 5.1.5 反应体系中GSH含量的测定 | 第74页 |
| 5.2 结果与讨论 | 第74-77页 |
| 5.2.1 蛋白支架的表达 | 第74-75页 |
| 5.2.2 蛋白支架组装ADK-DocⅡ、PAP-Doc1-3与GshF-Doc1-1用于谷胱甘肽的合成 | 第75页 |
| 5.2.3 反应条件的优化探索 | 第75-77页 |
| 5.2.3.1 温度对反应体系的影响 | 第75-76页 |
| 5.2.3.2 pH对反应体系的影响 | 第76-77页 |
| 5.3 小结 | 第77-78页 |
| 第六章 结论与展望 | 第78-80页 |
| 6.1 结论 | 第78-79页 |
| 6.2 展望 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-89页 |
| 作者筒介 | 第89页 |
