| 缩略词表 | 第5-6页 |
| 综 述 | 第6-22页 |
| 综述1 U1 snRNA及其在基因治疗中的作用 | 第6-12页 |
| 1 U1 snRNA的特点 | 第6-7页 |
| 2 U1 snRNA用于基因治疗主要方面 | 第7-12页 |
| 综述2 丙型肝炎治疗现状 | 第12-22页 |
| 1 加强对目前治疗方法反应性的措施 | 第12-14页 |
| 2 新策略:分子基础上的治疗 | 第14-18页 |
| 3 减少肝脏损害的策略 | 第18页 |
| 4 其它策略--调节宿主免疫反应 | 第18-22页 |
| 提 要 | 第22-23页 |
| 前 言 | 第23-25页 |
| 材料与方法 | 第25-35页 |
| 一、 仪器 | 第25-26页 |
| 二、 试剂及液体配制 | 第26-35页 |
| 实验一 HCV特异性U1-Rz在细胞外对靶基因的切割活性研究 | 第35-45页 |
| (一) U1-Rz原核表达载体的构建 | 第35-41页 |
| 1 氯化钙法感受态大肠杆菌的制备 | 第35页 |
| 2 质粒pBSIISK+U1的扩增 | 第35-36页 |
| 3 第一次PCR | 第36-37页 |
| 4 TA克隆PCR产物及扩增DNA | 第37页 |
| 5 pBSIISK+(U1-Rz)的构建 | 第37-38页 |
| 6 第二次PCR | 第38-39页 |
| 7 PCR产物回收 | 第39页 |
| 8 PCR产物的T/A克隆(pGEM?-T vector System I) | 第39页 |
| 9 蓝白斑筛选实验 | 第39-40页 |
| 10 进一步筛选阳性克隆及鉴定PCR片段插入方向 | 第40-41页 |
| (二) 体外转录 | 第41-42页 |
| 1 、线性化 | 第41页 |
| 2 、1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段 | 第41页 |
| 3 、体外转录 | 第41-42页 |
| (三) 嵌合体核酶细胞外切割反应分析 | 第42-45页 |
| 1 、切割反应与阳性对照及阴性对照 | 第42-43页 |
| 2 、不同体积比条件下Rz和U1-Rz对靶RNA的切割活性 | 第43页 |
| 3 、不同时间下Rz和U1-Rz对靶RNA的切割活性 | 第43-45页 |
| 实验二 U1-核酶嵌合体、核酶在细胞内对HCV基因组的切割活性研究 | 第45-55页 |
| 一、 U1-Rz真核表达载体的构建 | 第45-47页 |
| (一) 扩增pcDNA3.1(+) | 第45页 |
| (二) 扩增质粒pGEM(U1-Rz) | 第45页 |
| (三) 亚克隆 | 第45-46页 |
| (四) 克隆鉴定 | 第46-47页 |
| (五) 质粒的大量制备 | 第47页 |
| 二、 核酶(Rz)真核表达载体的构建和鉴定 | 第47-48页 |
| (一) Rz真核表达载体的构建 | 第47-48页 |
| (二) 克隆鉴定 | 第48页 |
| 三、 Huh7细胞系的维持与传代 | 第48-49页 |
| 四、 转染条件的优化 | 第49页 |
| 五、 细胞转染 | 第49-50页 |
| 六、 Western Blot检测瞬时表达的蛋白质 | 第50-53页 |
| (一) 细胞抽提液的准备 | 第50-51页 |
| (二) SDS-PAGE分析 | 第51页 |
| (三) 蛋白质的电转移 | 第51-52页 |
| (四) NC膜的封闭 | 第52页 |
| (五) 靶蛋白与第一抗体反应 | 第52页 |
| (六) 靶蛋白与第二抗体反应 | 第52-53页 |
| (七) 显色反应 | 第53页 |
| 七、 荧光强度的检测 | 第53-55页 |
| 实验三 HCV亚基因组复制子稳定表达细胞系的建立 | 第55-56页 |
| 一、 转染细胞的准备 | 第55页 |
| 二、 荧光素酶活性检测 | 第55-56页 |
| 结 果 | 第56-60页 |
| 讨 论 | 第60-72页 |
| 结 论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-84页 |
| 附 图 | 第84-89页 |
| 中文摘要 | 第89-93页 |
| 英文摘要 | 第93页 |
| 致 谢 | 第98-100页 |
