| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 术语及符号说明 | 第11-12页 |
| 第1章 绪论 | 第12-27页 |
| 1.1 生物修复 | 第12-13页 |
| 1.2 酯酶 | 第13-21页 |
| 1.2.1 细菌酯酶的分类 | 第14-16页 |
| 1.2.2 酯酶的催化反应机制 | 第16-17页 |
| 1.2.3 酯酶降解农药的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.2.4 酯酶降解增塑剂的研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3 细胞表面展示技术 | 第21-26页 |
| 1.3.1 细菌表面展示系统的构成 | 第21-22页 |
| 1.3.2 细菌表面展示研究进展 | 第22-26页 |
| 1.4 本研究的内容和目的 | 第26-27页 |
| 第2章 酯酶CarEW在E. coli BL21 (DE3) 中的异源表达、纯化及酶学性质测定 | 第27-53页 |
| 2.1 材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 实验菌株和载体 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第27-28页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第28页 |
| 2.1.4 培养基 | 第28页 |
| 2.1.5 常用试剂的配制 | 第28-30页 |
| 2.2 方法 | 第30-39页 |
| 2.2.1 酯酶CarEW序列分析 | 第30页 |
| 2.2.2 Bacillus subtilis K91基因组的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.3 酯酶CarEW全长基因的扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.4 PCR扩增产物与表达载体pEASY-E2的连接 | 第32页 |
| 2.2.5 重组质粒的转化 | 第32页 |
| 2.2.6 菌落PCR验证 | 第32-33页 |
| 2.2.7 重组质粒的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.8 感受态细胞的制备 | 第34页 |
| 2.2.9 重组质粒转化E.coli BL21 (DE3) 及菌落PCR验证 | 第34页 |
| 2.2.10 重组酯酶CarEW在大肠杆菌中的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.2.11 重组酯酶CarEW的纯化和鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.12 Bradford法蛋白定量 | 第36-37页 |
| 2.2.13 酯酶活性的测定 | 第37页 |
| 2.2.14 重组酯酶酶学性质的测定 | 第37-39页 |
| 2.3 结果与分析 | 第39-51页 |
| 2.3.1 基因序列分析 | 第39-41页 |
| 2.3.2 酯酶CarEW基因PCR扩增 | 第41-42页 |
| 2.3.3 重组质粒pEASY-E2-CarEW的构建 | 第42-43页 |
| 2.3.4 菌落PCR阳性克隆子的筛选与鉴定 | 第43页 |
| 2.3.5 重组酯酶CarEW的异源表达及纯化 | 第43-44页 |
| 2.3.6 重组酯酶CarEW酶学性质的测定 | 第44-51页 |
| 2.4 结论与讨论 | 第51-53页 |
| 第3章 重组酯酶CarEW对农药和增塑剂的降解机制研究 | 第53-70页 |
| 3.1 材料 | 第53-54页 |
| 3.1.1 主要试剂 | 第53-54页 |
| 3.1.2 主要仪器 | 第54页 |
| 3.2 方法 | 第54-60页 |
| 3.2.1 重组酯酶CarEW对农药的降解 | 第54-59页 |
| 3.2.2 重组酯酶CarEW对邻苯二甲酸二异丁酯的降解 | 第59-60页 |
| 3.3 结果与分析 | 第60-68页 |
| 3.3.1 重组酯酶CarEW对农药的降解分析 | 第60-63页 |
| 3.3.2 重组酯酶CarEW对邻苯二甲酸二异丁酯的降解分析 | 第63-68页 |
| 3.4 结论与讨论 | 第68-70页 |
| 第4章 酯酶CarEW在E.coli BL21 (DE3) 表面展示的工程菌构建 | 第70-92页 |
| 4.1 材料 | 第70-73页 |
| 4.1.1 实验菌株和质粒 | 第70-71页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第71-72页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第72页 |
| 4.1.4 培养基 | 第72页 |
| 4.1.5 常用试剂的配制 | 第72-73页 |
| 4.2 方法 | 第73-78页 |
| 4.2.1 引物的合成 | 第73页 |
| 4.2.2 重组质粒pET28-CarEW的构建 | 第73-75页 |
| 4.2.3 重组质粒pET28-CarEW/gfp的构建 | 第75-76页 |
| 4.2.4 重组质粒pET28-N/CarEW的构建 | 第76-77页 |
| 4.2.5 重组质粒pET28-N/CarEW/gfp的构建 | 第77页 |
| 4.2.6 重组质粒转化到E.coli BL21 (DE3) | 第77页 |
| 4.2.7 细胞表面展示酯酶CarEW在大肠杆菌中的诱导表达 | 第77页 |
| 4.2.8 表面展示菌全细胞酶活性的测定 | 第77-78页 |
| 4.3 细胞表面展示定位分析 | 第78-79页 |
| 4.3.1 蛋白酶K敏感性分析 | 第78页 |
| 4.3.2 细胞分级分离和Western Blot检测 | 第78-79页 |
| 4.3.3 荧光显微镜检测 | 第79页 |
| 4.4 表面展示重组菌全细胞酯酶活性的测定 | 第79-80页 |
| 4.4.1 表面展示重组菌最适p H的测定 | 第79页 |
| 4.4.2 表面展示重组菌最适温度的测定 | 第79页 |
| 4.4.3 表面展示重组菌对不同碳链长度p-NP酯底物活性测定 | 第79-80页 |
| 4.4.4 表面展示重组菌全细胞在不同温度下酶活性的变化 | 第80页 |
| 4.5 结果与分析 | 第80-85页 |
| 4.5.1 重组质粒目的基因的获得 | 第80-81页 |
| 4.5.2 重组质粒的构建 | 第81-82页 |
| 4.5.3 菌落PCR验证 | 第82-85页 |
| 4.6 细胞表面定位分析 | 第85-87页 |
| 4.6.1 蛋白酶K敏感性分析 | 第85页 |
| 4.6.2 细胞分级分离产物的Western Blot分析 | 第85-86页 |
| 4.6.3 荧光显微镜镜检分析 | 第86-87页 |
| 4.7 表面展示重组菌全细胞酯酶活性的测定结果 | 第87-90页 |
| 4.7.1 表面展示重组菌最适p H和最适温度 | 第87-89页 |
| 4.7.2 表面展示重组菌对不同碳链长度p-NP酯底物的水解活性 | 第89页 |
| 4.7.3 表面展示重组菌全细胞在不同温度下酶活性的变化 | 第89-90页 |
| 4.8 结论与讨论 | 第90-92页 |
| 第5章 总结和展望 | 第92-95页 |
| 5.1 总结 | 第92-93页 |
| 5.2 创新点 | 第93-94页 |
| 5.3 展望 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-104页 |
| 附录 | 第104-108页 |
| 攻读学位期间发表的论文和研究成果 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109页 |
