| 致谢 | 第5-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-30页 |
| 1.1 甾体化合物 | 第16-18页 |
| 1.1.1 甾体化合物概述 | 第16页 |
| 1.1.2 甾体药物 | 第16-18页 |
| 1.2 甾体化合物的合成 | 第18-20页 |
| 1.2.1 甾体合成研究史 | 第18页 |
| 1.2.2 甾体化合物的化学合成 | 第18-19页 |
| 1.2.3 甾体化合物的微生物转化 | 第19-20页 |
| 1.3 9α-OH-AD与甾体的9α-羟基化 | 第20-21页 |
| 1.4 3-甾酮-9α-羟基化酶 | 第21-24页 |
| 1.4.1 3-甾酮-9α-羟基化酶概述 | 第21-23页 |
| 1.4.2 3-甾酮-9α-羟基化酶系统的构成与酶学分类 | 第23页 |
| 1.4.3 3-甾酮-9α-羟基化酶系统的催化反应机理 | 第23-24页 |
| 1.5 国内外相关研究现状 | 第24-27页 |
| 1.5.1 甾体的9α-羟基化与3-甾酮-9α-羟基化酶的研究现状 | 第24-27页 |
| 1.5.2 应用大肠杆菌进行甾体9α-羟基化的研究现状 | 第27页 |
| 1.6 本课题的研究背景意义与主要内容 | 第27-30页 |
| 1.6.1 本课题的研究背景与意义 | 第27-28页 |
| 1.6.2 本课题的主要研究内容 | 第28-30页 |
| 第二章 KshA的筛选、表达与活性验证 | 第30-52页 |
| 2.1 前言 | 第30页 |
| 2.2 材料与实验设备 | 第30-33页 |
| 2.2.1 质粒和菌种 | 第30页 |
| 2.2.2 酶及分子生物学试剂 | 第30-31页 |
| 2.2.3 化学试剂 | 第31页 |
| 2.2.4 培养基配制 | 第31页 |
| 2.2.5 溶液配制 | 第31-32页 |
| 2.2.6 主要实验仪器 | 第32-33页 |
| 2.3 实验方法 | 第33-40页 |
| 2.3.1 kshA基因序列的选择与获取 | 第33页 |
| 2.3.2 重组大肠杆菌的构建 | 第33-37页 |
| 2.3.3 重组菌株的诱导表达与蛋白检测 | 第37-38页 |
| 2.3.4 9α-OH-AD标准曲线的建立 | 第38-39页 |
| 2.3.5 重组菌株转化AD制备9α-OH-AD的检测 | 第39页 |
| 2.3.6 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-kshA-reyh催化甾体9α-羟基化反应优化 | 第39-40页 |
| 2.3.7 KshA-re的分离纯化 | 第40页 |
| 2.3.8 KshA-re的酶活测定 | 第40页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第40-51页 |
| 2.4.1 基因的获取与密码子优化 | 第40-44页 |
| 2.4.2 重组载体的构建 | 第44-45页 |
| 2.4.3 重组菌株的诱导表达与反应研究 | 第45-47页 |
| 2.4.4 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-kshA-resy的反应优化 | 第47-50页 |
| 2.4.5 KshA-re的分离纯化与反应研究 | 第50-51页 |
| 2.5 本章小结 | 第51-52页 |
| 第三章 KshB的表达与活性验证 | 第52-60页 |
| 3.1 前言 | 第52页 |
| 3.2 材料与实验设备 | 第52-53页 |
| 3.2.1 质粒和菌种 | 第52页 |
| 3.2.2 酶及分子生物学试剂 | 第52页 |
| 3.2.3 化学试剂 | 第52页 |
| 3.2.4 主要实验仪器 | 第52-53页 |
| 3.3 实验方法 | 第53-55页 |
| 3.3.1 基因序列的选择与密码子优化 | 第53页 |
| 3.3.2 重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a-kshB-reyh的构建 | 第53-54页 |
| 3.3.3 重组菌株的诱导表达及分离纯化 | 第54页 |
| 3.3.4 KshB的功能验证 | 第54-55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-59页 |
| 3.4.1 kshB基因的获取与密码子优化 | 第55-57页 |
| 3.4.2 重组质粒pET28a-kshB-reyh的构建 | 第57-58页 |
| 3.4.3 重组菌株的诱导表达蛋白电泳分析 | 第58页 |
| 3.4.4 KshB-re的活性验证 | 第58-59页 |
| 3.5 本章小结 | 第59-60页 |
| 第四章 辅基对KshA活性的影响 | 第60-72页 |
| 4.1 前言 | 第60-61页 |
| 4.2 材料与实验设备 | 第61-62页 |
| 4.2.1 质粒和菌种 | 第61页 |
| 4.2.2 酶及分子生物学试剂 | 第61页 |
| 4.2.3 化学试剂 | 第61页 |
| 4.2.4 主要实验仪器 | 第61-62页 |
| 4.2.5 本章使用的引物序列 | 第62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-64页 |
| 4.3.1 重组质粒pETDuet-kshA-kshB的构建 | 第62-63页 |
| 4.3.2 质粒pET28a-p450 bm3的改造 | 第63页 |
| 4.3.3 重组质粒pET28a-kshA-p450的构建 | 第63页 |
| 4.3.4 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-kshA-p450与BL21(DE3)-pETDuet-kshA-kshB的构建 | 第63-64页 |
| 4.3.5 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-kshA-p450与BL21(DE3)-pETDuet-kshA-kshB的诱导表达与蛋白检测 | 第64页 |
| 4.3.6 重组菌株BL21(DE3)-pET28a-kshA-p450与BL21(DE3)-pETDuet-kshA-kshB催化AD制备9α-OH-AD的反应研究 | 第64页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第64-70页 |
| 4.4.1 重组质粒pETDuet-kshA-kshB的构建 | 第64-66页 |
| 4.4.2 质粒pET28a-p450 bm3的改造 | 第66-67页 |
| 4.4.3 重组质粒pET28a-kshA-p450的构建 | 第67-69页 |
| 4.4.4 重组菌株的诱导表达蛋白电泳分析 | 第69页 |
| 4.4.5 重组菌株的催化活性研究 | 第69-70页 |
| 4.5 本章小结 | 第70-72页 |
| 第五章 共表达辅酶再生体系的研究 | 第72-84页 |
| 5.1 前言 | 第72页 |
| 5.2 材料与实验设备 | 第72-73页 |
| 5.2.1 质粒和菌种 | 第72页 |
| 5.2.2 酶及分子生物学试剂 | 第72页 |
| 5.2.3 化学试剂 | 第72页 |
| 5.2.4 主要实验仪器 | 第72-73页 |
| 5.2.5 本章使用的引物序列 | 第73页 |
| 5.3 实验方法 | 第73-76页 |
| 5.3.1 质粒pCDFDuet-fdh的三位点突变 | 第73-74页 |
| 5.3.2 重组质粒pETDuet-fdh3m的构建 | 第74-75页 |
| 5.3.3 重组质粒pETDuet-kshA-kshB-fdh3m的构建 | 第75页 |
| 5.3.4 重组质粒pETDuet-kshAp450-fdh3m的构建 | 第75-76页 |
| 5.3.5 重组菌株BL21(DE3)-pETDuet-kshA-kshB-fdh3m与BL21(DE3)-pETDuet-kshAp450-fdh3m的构建 | 第76页 |
| 5.3.6 重组菌株的诱导表达与蛋白检测 | 第76页 |
| 5.3.7 重组菌株催化AD制备9α-OH-AD的催化反应研究 | 第76页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第76-83页 |
| 5.4.1 质粒pCDFDuet-fdh的三位点突变 | 第76-77页 |
| 5.4.2 重组质粒pETDuet-fdh3m的构建 | 第77-78页 |
| 5.4.3 重组质粒pETDuet-kshA-kshB-fdh3m的构建 | 第78-80页 |
| 5.4.4 重组质粒pETDuet-kshAp450-fdh3m的构建 | 第80-81页 |
| 5.4.5 重组菌株的蛋白诱导表达及电泳分析 | 第81-82页 |
| 5.4.6 重组菌株的催化活性研究 | 第82-83页 |
| 5.5 本章小结 | 第83-84页 |
| 第六章 结论与展望 | 第84-86页 |
| 6.1 结论 | 第84-85页 |
| 6.2 展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-92页 |
