| 摘要 | 第4-7页 |
| abstract | 第7-10页 |
| 第一章 绪论 | 第16-32页 |
| 一 AAV的生物学特性及生活史 | 第16-19页 |
| 1 AAV的发现 | 第16页 |
| 2 AAV的生物学特性 | 第16-18页 |
| 3 AAV的生活史 | 第18-19页 |
| 二 ITR的结构与功能 | 第19-25页 |
| 1 ITR的序列及二级结构 | 第19-20页 |
| 2 ITR的功能 | 第20-25页 |
| 三 ITR不同regions的分子作用 | 第25-27页 |
| 1 ITR A-A’ region中的重要元件及作用 | 第25-26页 |
| 2 ITR B-B’及C-C’ regions中的重要元件及作用 | 第26页 |
| 3 ITR中D region的作用 | 第26-27页 |
| 4 AAV5的ITR | 第27页 |
| 四 ITR的突变及影响 | 第27-29页 |
| 1 ITR中HP的突变及其影响 | 第27-28页 |
| 2 ITR中D region的突变及其影响 | 第28-29页 |
| 3 杂合ITR的作用 | 第29页 |
| 五 wt ITR抑制了AAV的表达 | 第29-30页 |
| 1 共济失调?毛细血管扩张突变蛋白抑制wt ITR的AAV表达 | 第29-30页 |
| 2 Mre11复合体抑制wt ITR的AAV表达 | 第30页 |
| 六 论文设计 | 第30-32页 |
| 1 立题依据 | 第30页 |
| 2 论文目标 | 第30-31页 |
| 3 设计思路 | 第31页 |
| 4 技术路线 | 第31-32页 |
| 第二章 一侧ITR缺失突变对rAAV包装效率及表达水平的影响 | 第32-54页 |
| 一 材料、试剂和仪器 | 第32-36页 |
| 1 质粒和菌株 | 第32页 |
| 2 细胞 | 第32页 |
| 3 常用的酶及试剂盒 | 第32-33页 |
| 4 常用试剂 | 第33页 |
| 5 主要缓冲液 | 第33-35页 |
| 6 细菌培养基 | 第35页 |
| 7 主要仪器设备 | 第35-36页 |
| 二 实验方法 | 第36-42页 |
| 1 一侧ITR缺失突变的rAAV载体质粒的构建 | 第36页 |
| 2 质粒的大量制备 | 第36-37页 |
| 3 三质粒共转染法包装rAAV | 第37页 |
| 4 rAAV的收获及纯化 | 第37页 |
| 5 SDS-PAGE检测rAAV外壳蛋白纯度 | 第37页 |
| 6 rAAV颗粒浓度的测定 | 第37页 |
| 7 rAAV基因组物理滴度的测定 | 第37-39页 |
| 8 Southern blotting检测rAAV基因组完整性 | 第39-41页 |
| 9 Hirt法提取细胞染色体外DNA | 第41页 |
| 10 rAAV基因组拯救及复制效率的比较 | 第41-42页 |
| 11 体外EGFP的表达测定 | 第42页 |
| 12 数据分析 | 第42页 |
| 三 结果与分析 | 第42-52页 |
| 1 野生型AAV2 ITR的序列分析 | 第42-43页 |
| 2 ITR缺失突变体的序列设计 | 第43页 |
| 3 一侧ITR缺失突变的rAAV载体质粒的构建 | 第43-44页 |
| 4 一侧ITR缺失突变的rAAV的包装效率 | 第44-49页 |
| 5 一侧ITR缺失突变对rAAV基因组拯救及复制效率的影响 | 第49-50页 |
| 6 一侧ITR缺失突变的rAAV的体外表达水平 | 第50-52页 |
| 四 讨论 | 第52-53页 |
| 五 本章小结 | 第53-54页 |
| 第三章 双侧ITR缺失突变对rAAV包装效率及表达水平的影响 | 第54-77页 |
| 一 材料、试剂和仪器 | 第54-56页 |
| 1 质粒和菌株 | 第54页 |
| 2 细胞 | 第54-55页 |
| 3 试验动物 | 第55页 |
| 4 常用的酶及试剂盒 | 第55页 |
| 5 常用试剂 | 第55页 |
| 6 主要缓冲液 | 第55页 |
| 7 细菌培养基 | 第55页 |
| 8 主要仪器设备 | 第55-56页 |
| 二 实验方法 | 第56-58页 |
| 1 双侧ITR缺失突变的r AAV载体质粒的构建 | 第56页 |
| 2 三质粒共转染法包装rAAV | 第56页 |
| 3 rAAV的收获及纯化 | 第56页 |
| 4 SDS-PAGE检测rAAV外壳蛋白纯度 | 第56页 |
| 5 rAAV颗粒浓度的测定 | 第56页 |
| 6 rAAV基因组物理滴度的测定 | 第56页 |
| 7 Southern blotting检测rAAV基因组完整性 | 第56页 |
| 8 rAAV基因组拯救及复制效率的比较 | 第56-57页 |
| 9 EGFP的表达测定 | 第57页 |
| 10 分泌型Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)的活性检测 | 第57-58页 |
| 11 数据分析 | 第58页 |
| 三 结果与分析 | 第58-74页 |
| 1 双侧ITR缺失突变体的序列设计 | 第58-59页 |
| 2 双侧ITR缺失突变的rAAV载体构建 | 第59-60页 |
| 3 rAAV载体质粒中ITR缺失突变体的序列验证 | 第60-61页 |
| 4 双侧ITR缺失突变的rAAV的包装 | 第61-64页 |
| 5 rAAVbiΔBC包装效率下降的原因 | 第64-66页 |
| 6 rAAVbiΔBC的体外表达 | 第66-69页 |
| 7 rAAVbiΔBC的体内表达 | 第69-70页 |
| 8 rAAVbiΔBC的包装容量 | 第70-72页 |
| 9 双侧ITR缺失B-B’及C-C’ regions的rscAAV的包装 | 第72-74页 |
| 10 rscAAVbiΔBC的体外表达 | 第74页 |
| 四 讨论 | 第74-76页 |
| 五 本章小结 | 第76-77页 |
| 第四章 rAAVbiΔBC表达水平升高的机制研究 | 第77-86页 |
| 一 材料、试剂和仪器 | 第77-78页 |
| 1 质粒及病毒 | 第77页 |
| 2 细胞 | 第77页 |
| 3 常用的酶及试剂盒 | 第77页 |
| 4 常用试剂 | 第77-78页 |
| 5 主要缓冲液配制 | 第78页 |
| 6 主要仪器设备 | 第78页 |
| 二 实验方法 | 第78-80页 |
| 1 β 半乳糖苷酶活性的测定 | 第78-79页 |
| 2 Hirt法提取细胞染色体外DNA | 第79页 |
| 3 ATM抑制剂对r AAV表达水平的影响 | 第79页 |
| 4 Mre11抑制剂对rAAV表达水平的影响 | 第79页 |
| 5 降解MRN对rAAV表达水平的影响 | 第79-80页 |
| 三 结果与分析 | 第80-84页 |
| 1 rAAVbiΔBC的高水平表达与其所含的极少量双链基因组无关 | 第80-81页 |
| 2 抑制ATM使rAAVwt表达水平升高幅度大于rAAVbiΔBC | 第81-82页 |
| 3 抑制或降解MRN使rAAVwt表达水平升高幅度大于rAAVbiΔBC | 第82-83页 |
| 4 双侧ITR缺失B-B’及C-C’ regions不能提高rAAV载体质粒及基因组DNA的表达水平 | 第83-84页 |
| 四 讨论 | 第84-85页 |
| 五 本章小结 | 第85-86页 |
| 第五章 rAAVbiΔBC的应用初探 | 第86-94页 |
| 一 材料、试剂和仪器 | 第87-88页 |
| 1 质粒和菌株 | 第87页 |
| 2 细胞 | 第87页 |
| 3 实验动物 | 第87页 |
| 4 常用的酶及试剂盒 | 第87页 |
| 5 常用试剂 | 第87-88页 |
| 6 主要缓冲液配制 | 第88页 |
| 7 主要仪器设备 | 第88页 |
| 二 实验方法 | 第88-90页 |
| 1 携带hFIX表达框的rAAV-hFIX的包装、纯化、质检及定量 | 第88-89页 |
| 2 实验小鼠的分组及饲养 | 第89页 |
| 3 小鼠尾静脉常压注射 | 第89页 |
| 4 小鼠血浆的采集 | 第89页 |
| 5 ELISA检测模型小鼠血浆中hFIX表达水平 | 第89-90页 |
| 三 结果与分析 | 第90-92页 |
| 1 hFIX基因表达框的选择 | 第90页 |
| 2 携带hFIX基因表达框的两种rAAV载体质粒的构建 | 第90页 |
| 3 rAAV8wt-hFIX及rAAV8biΔBC-h FIX的包装及品质检测 | 第90-91页 |
| 4 rAAV8biΔBC-hFIX的体内高水平表达 | 第91-92页 |
| 四 讨论 | 第92-93页 |
| 五 本章小结 | 第93-94页 |
| 结论 | 第94-96页 |
| 参考文献 | 第96-106页 |
| 个人简历 | 第106-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
