| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第11-28页 |
| 1 新城疫病毒概述 | 第11-18页 |
| ·新城疫病毒形态特征和理化特征 | 第11页 |
| ·新城疫病毒的生物学活性 | 第11-12页 |
| ·血凝性 | 第11页 |
| ·神经氨酸酶活性 | 第11-12页 |
| ·细胞融合与溶血 | 第12页 |
| ·新城疫病毒的培养特性 | 第12页 |
| ·新城疫病毒的致病性 | 第12-13页 |
| ·新城疫病毒的抗肿瘤特性 | 第13页 |
| ·新城疫病毒的变异 | 第13-14页 |
| ·新城疫病毒的宿主范围 | 第14页 |
| ·新城疫病毒的分子生物学特征 | 第14-18页 |
| ·NP蛋白 | 第15-16页 |
| ·P蛋白 | 第16页 |
| ·M蛋白 | 第16-17页 |
| ·F蛋白 | 第17页 |
| ·HN蛋白 | 第17-18页 |
| ·L蛋白 | 第18页 |
| 2 新城疫病毒毒力强弱的分子生物学基础 | 第18-22页 |
| ·病毒囊膜蛋白 主要毒力决定因素 | 第18-20页 |
| ·免疫逃避和毒力 | 第20-21页 |
| ·复制和毒力 | 第21-22页 |
| ·非编码区和毒力 | 第22页 |
| 3 新城疫疫苗的研究进展 | 第22-27页 |
| ·新城疫传统疫苗 | 第22-24页 |
| ·活疫苗 | 第22-23页 |
| ·灭活疫苗 | 第23-24页 |
| ·新城疫基因工程疫苗 | 第24-26页 |
| ·亚单位疫苗 | 第24页 |
| ·核酸疫苗 | 第24-25页 |
| ·重组活载体疫苗 | 第25页 |
| ·病毒颗粒疫苗 | 第25-26页 |
| ·利用反向遗传技术的新城疫疫苗 | 第26-27页 |
| ·卵内疫苗 | 第26页 |
| ·新城疫病毒载体疫苗 | 第26-27页 |
| 4 本研究的目的和意义 | 第27-28页 |
| 第二部分 新城疫病毒HN09-69株NP、P、M、F、HN基因的克隆 | 第28-48页 |
| 引言 | 第28页 |
| 1 材料与方法 | 第28-36页 |
| ·材料 | 第28-30页 |
| ·毒株 | 第28页 |
| ·SPF鸡胚 | 第28页 |
| ·质粒和菌种 | 第28-29页 |
| ·主要试剂 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29页 |
| ·试剂的配制 | 第29-30页 |
| I.1.6.1 琼脂糖凝胶电泳试剂 | 第29页 |
| ·感受态细胞的制备及转化溶液配制 | 第29-30页 |
| ·细胞培养基的配制 | 第30页 |
| ·方法 | 第30-36页 |
| ·引物设计 | 第30-31页 |
| ·病毒增殖 | 第31页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第31-32页 |
| ·NDV NP、P、M、F和HN基因的RT-PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·反转录(RT) | 第32页 |
| ·PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的回收与纯化 | 第33页 |
| ·重组克隆质粒的构建 | 第33-35页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第33页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 | 第33-34页 |
| ·连接产物的转化 | 第34页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒的提取 | 第34-35页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第35页 |
| ·序列测定 | 第35页 |
| ·同源性比较、序列分析、基因分型及进化树的绘制 | 第35-36页 |
| ·NP、P、M、F和HN蛋白结构功能域预测 | 第36页 |
| 2 结果与分析 | 第36-47页 |
| ·NP、P、M、F和HN基因的扩增 | 第36-37页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第37-38页 |
| ·序列和遗传进化分析 | 第38-41页 |
| ·NP、P、M、F和HN蛋白结构功能域预测 | 第41-47页 |
| ·NP蛋白跨膜区、信号肽、抗原区域预测 | 第41-42页 |
| ·P蛋白跨膜区、信号肽、抗原区域预测 | 第42-43页 |
| ·M蛋白跨膜区、信号肽、抗原区域预测 | 第43-44页 |
| ·F蛋白跨膜区、信号肽、抗原区域预测 | 第44-45页 |
| ·HN蛋白跨膜区、信号肽、抗原区域预测 | 第45-47页 |
| 3 讨论 | 第47-48页 |
| 第三部分 新城疫病毒NP、P、M、F、HN、V基因的原核表达及鉴定 | 第48-72页 |
| 引言 | 第48页 |
| 1 材料与方法 | 第48-56页 |
| ·材料 | 第48-51页 |
| ·毒株 | 第48页 |
| ·SPF鸡 | 第48页 |
| ·重组克隆质粒、原核表达载体及表达菌株 | 第48页 |
| ·主要试剂 | 第48页 |
| ·主要仪器 | 第48-49页 |
| ·SDS-PAGE电泳所用试剂 | 第49-50页 |
| ·Western blot试剂的配制 | 第50页 |
| ·蛋白纯化试剂 | 第50-51页 |
| ·ELISA试剂 | 第51页 |
| ·试验方法 | 第51-56页 |
| ·引物设计 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增与纯化回收 | 第52-53页 |
| ·NP、P、M、F、HN基因的扩增 | 第52-53页 |
| ·V基因的OE-PCR扩增 | 第53页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第53-54页 |
| ·PCR产物和pET-28a(+)载体的酶切回收 | 第53-54页 |
| ·目的基因与表达质粒的连接 | 第54页 |
| ·连接产物的转化 | 第54页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第54-55页 |
| ·菌液PCR鉴定 | 第54页 |
| ·质粒提取 | 第54页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第54-55页 |
| ·测序 | 第55页 |
| ·NP、P、M、F、HN、V基因原核表达与鉴定 | 第55-56页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第55页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第55页 |
| ·融合蛋白诱导表达条件的优化 | 第55-56页 |
| ·Western blot鉴定 | 第56页 |
| ·NP和P融合蛋白的大量纯化及对鸡的免疫保护试验 | 第56页 |
| ·NP和P融合蛋白纯化 | 第56页 |
| ·纯化蛋白的浓缩及浓度测定 | 第56页 |
| ·NP、P融合蛋白对鸡的免疫保护试验 | 第56页 |
| 2 结果与分析 | 第56-71页 |
| ·NP、P、M、F、HN和V基因的扩增 | 第56-57页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第57-58页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第58-59页 |
| ·重组质粒的原核表达及鉴定 | 第59-69页 |
| ·SDS-PAGE检测诱导表达的融合蛋白 | 第59-60页 |
| ·融合蛋白的可溶性分析 | 第60-62页 |
| ·重组质粒诱导表达的条件优化 | 第62-68页 |
| ·最佳IPTG浓度的确定 | 第62-65页 |
| ·最佳诱导时间的确定 | 第65-68页 |
| ·Western blot鉴定 | 第68-69页 |
| ·NP、P融合蛋白的大量纯化及对鸡的免疫保护试验 | 第69-71页 |
| ·NP、P融合蛋白纯化 | 第69页 |
| ·纯化蛋白的浓缩及浓度测定 | 第69-70页 |
| ·NP、P融合蛋白对鸡的免疫保护试验 | 第70-71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 第四部分 全文总结 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 英文摘要 | 第81-82页 |
