| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-11页 |
| 目录 | 第11-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-25页 |
| ·细菌小RNA的研究进展 | 第15-20页 |
| ·发现小RNA的历史 | 第15页 |
| ·鉴定细菌小RNA的方法 | 第15-17页 |
| ·细菌小RNA的生物学功能 | 第17-19页 |
| ·细菌小RNA的作用机制 | 第19-20页 |
| ·黄单胞菌小RNA研究概况 | 第20-21页 |
| ·十字花科黑腐病菌的分子生物学研究简介 | 第21-24页 |
| ·十字花科黑腐病菌简介 | 第21页 |
| ·十字花科黑腐病菌致病机理 | 第21-23页 |
| ·十字花科黑腐病菌重金属离子代谢研究简介 | 第23-24页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 第二章 材料与方法 | 第25-48页 |
| ·供试菌株和质粒 | 第25-26页 |
| ·本研究所用引物与探针 | 第26-29页 |
| ·使用的抗生素及试剂 | 第29-30页 |
| ·培养基,培养条件和菌种保藏 | 第30-31页 |
| ·培养基 | 第30-31页 |
| ·菌株的培养和保存 | 第31页 |
| ·常用试剂及缓冲液 | 第31-33页 |
| ·细菌总DNA的提取 | 第33页 |
| ·质粒的提取 | 第33-34页 |
| ·快速碱裂解法 | 第33-34页 |
| ·试剂盒提取法 | 第34页 |
| ·PCR反应 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·模板制备 | 第34-35页 |
| ·PCR反应体系 | 第35页 |
| ·反应条件 | 第35页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第35-36页 |
| ·DNA的纯化和回收 | 第36页 |
| ·DNA的纯化 | 第36页 |
| ·DNA的回收 | 第36页 |
| ·DNA的酶切 | 第36页 |
| ·DNA片段的连接 | 第36-37页 |
| ·转化 | 第37-38页 |
| ·化转感受态的制备 | 第37页 |
| ·化学转化法 | 第37-38页 |
| ·三亲本接合 | 第38页 |
| ·缺失突变体的构建 | 第38页 |
| ·过量表达株的构建 | 第38页 |
| ·菌株的表型检测 | 第38-40页 |
| ·菌株的致病性检测 | 第38-39页 |
| ·过敏性反应(HR)检测 | 第39页 |
| ·胞外多糖(EPS)的检测 | 第39页 |
| ·胞外酶的检测 | 第39-40页 |
| ·游动性检测 | 第40页 |
| ·金属耐受性检测 | 第40页 |
| ·生物膜形成检测 | 第40页 |
| ·细菌总RNA的提取：(SDS-酸酚法) | 第40-42页 |
| ·实验准备及注意事项 | 第40-41页 |
| ·步骤 | 第41-42页 |
| ·RNA质量的检测及浓度的测定 | 第42页 |
| ·细菌总RNA中DNA的去除 | 第42-43页 |
| ·Northern杂交 | 第43-46页 |
| ·实验准备 | 第43页 |
| ·分离RNA | 第43-44页 |
| ·半干式电转仪转膜 | 第44页 |
| ·预杂交 | 第44页 |
| ·杂交 | 第44-45页 |
| ·显影及定影 | 第45-46页 |
| ·受ZnSO_4和EDTA影响的Xcc 8004的小RNA的Solexa文库的构建和测序 | 第46页 |
| ·RPKM值的计算 | 第46页 |
| ·总RNA中小片段RNA分子的回收 | 第46-47页 |
| ·RT-PCR | 第47-48页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第47页 |
| ·4.2 半定量RT-PCR | 第47-48页 |
| 第三章 在全基因组水平上鉴定Xcc 8004中表达受ZnSO_4和EDTA影响的小RNA | 第48-70页 |
| ·在全基因组水平上鉴定表达受ZnSO_4和EDTA影响的小RNA的策略 | 第48-49页 |
| ·ZnSO_4和EDTA使用浓度的确定 | 第49-50页 |
| ·表达受ZnSO_4和EDTA影响的小RNA的全基因组鉴定 | 第50-64页 |
| ·Xcc 8004的培养及总RNA提取 | 第50-51页 |
| ·小分子RNA(50-500nt)的分离和纯化 | 第51页 |
| ·50-500nt RNA的cDNA库的构建及Solexa测序 | 第51-52页 |
| ·Solexa序列在Xcc 8004基因组上的定位 | 第52-53页 |
| ·表达受ZnSO_4和EDTA影响的候选小RNA的确定 | 第53-54页 |
| ·表达受ZnSO_4和EDTA影响的候选小RNA的验证 | 第54-64页 |
| ·小RNA基因转录方向的确定 | 第64-70页 |
| ·Northern杂交和链特异RT-PCR鉴定小RNA基因转录方向的原理 | 第65-67页 |
| ·通过Northern杂交确定小RNA基因转录方向 | 第67-68页 |
| ·通过链特异RT-PCR确定小RNA基因转录方向 | 第68-70页 |
| 第四章 六个表达受ZnSO_4和EDTA影响的小RNA的功能鉴定 | 第70-97页 |
| ·鉴定小RNA功能的策略 | 第70页 |
| ·进行功能鉴定的6个小RNA在Xcc 8004基因组内的位置 | 第70-71页 |
| ·小RNA缺失突变体的构建 | 第71-77页 |
| ·小RNA缺失突变体构建策略 | 第71-72页 |
| ·小RNA缺失突变体构建过程 | 第72-77页 |
| ·小RNA过量表达株的构建 | 第77-81页 |
| ·小RNA过量表达株的构建策略 | 第77-78页 |
| ·小RNA过量表达株的构建过程 | 第78-81页 |
| ·小RNA缺失突变体和过量表达菌株的表型分析 | 第81-95页 |
| ·缺失突变体和过量表达株对金属离子耐受性分析 | 第82-86页 |
| ·缺失突变体和过量表达株对SDS和EDTA的耐受性分析 | 第86-88页 |
| ·缺失突变体和过量表达株的胞外酶活性和胞外多糖产量的初步分析 | 第88-90页 |
| ·缺失突变体和过量表达株的游动性和生物膜形成的检测 | 第90-92页 |
| ·缺失突变体和过量表达株的致病力和HR.反应的检测 | 第92-95页 |
| ·小结 | 第95-97页 |
| 第五章 总结与讨论 | 第97-100页 |
| ·总结 | 第97页 |
| ·讨论 | 第97-99页 |
| ·后续工作 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-109页 |
| 附表 | 第109-121页 |
| 致谢 | 第121-122页 |
| 攻读硕士学位期间完成的研究论文 | 第122页 |
