| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-20页 |
| ·蚯蚓纤溶酶 | 第9-16页 |
| ·蚯蚓纤溶酶简介 | 第9页 |
| ·蚯蚓纤溶酶(EFE)的研究进展 | 第9-16页 |
| ·EST研究进展 | 第16-17页 |
| ·电子克隆技术 | 第17-18页 |
| ·本研究的目的意义 | 第18-20页 |
| 第二章 电子克隆技术探究 | 第20-26页 |
| ·前言 | 第20页 |
| ·电子克隆的具体步骤 | 第20-26页 |
| ·选择合适的种子序列 | 第20-21页 |
| ·对序列进行预处理 | 第21页 |
| ·用种子序列对dbEST用BLAST进行同源性搜索 | 第21页 |
| ·通过软件程序对BLAST结果电子拼接 | 第21-23页 |
| ·对拼接结果contig作开放阅读框(ORF)分析 | 第23-24页 |
| ·实验验证电子克隆结果 | 第24页 |
| ·电子克隆中有待解决的困难 | 第24-26页 |
| 第三章 蚯蚓纤溶酶F-I-O基因的电子克隆 | 第26-37页 |
| ·材料和方法 | 第26-27页 |
| ·电子克隆方法步骤 | 第26页 |
| ·生物信息学软件、数据库和网址 | 第26-27页 |
| ·结果与分析 | 第27-36页 |
| ·电子克隆结果 | 第27-33页 |
| ·验证dbEST(Lumbricidae)的完整性 | 第27-31页 |
| ·F-I-O基因的电子克隆： | 第31-33页 |
| ·结果序列在NCBI的dbEST中BLAST比对 | 第33页 |
| ·生物信息学预测分析 | 第33-36页 |
| ·DNAMAN分析成熟肽 | 第33页 |
| ·氨基酸色谱分析 | 第33-34页 |
| ·蛋白质亚细胞定位分析 | 第34页 |
| ·蛋白位点基序(motif)搜索 | 第34-35页 |
| ·SMART结构域预测 | 第35页 |
| ·糖基化位点分析 | 第35-36页 |
| ·讨论 | 第36-37页 |
| 第四章 蚯蚓纤溶酶F-I-O基因的克隆 | 第37-53页 |
| ·主要实验材料与设备 | 第37-38页 |
| ·实验材料与试剂 | 第37页 |
| ·主要实验仪器 | 第37-38页 |
| ·主要试剂配制 | 第38页 |
| ·实验方法 | 第38-44页 |
| ·Trizol一步法提取蚯蚓总RNA | 第38-39页 |
| ·RNA甲醛凝胶电泳 | 第39页 |
| ·F-I-O组分的引物设计 | 第39页 |
| ·反转录合成cDNA第一条链 | 第39-40页 |
| ·PCR扩增蚯蚓纤溶酶基因片段 | 第40页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳回收 | 第40-41页 |
| ·感受态细菌制备 | 第41页 |
| ·连接入Takara pMD19-T载体 | 第41-42页 |
| ·CaCl2法将质粒转化入感受态细胞 | 第42-43页 |
| ·小量碱裂解法提取纯化质粒 | 第43页 |
| ·重组质粒的EcoR I酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·PCR鉴定重组质粒 | 第44页 |
| ·实验结果与讨论 | 第44-53页 |
| ·蚯蚓总RNA的提取 | 第44页 |
| ·RT-PCR反应 | 第44-45页 |
| ·100uL体系的PCR产物回收的结果 | 第45页 |
| ·感受态细菌制备 | 第45-47页 |
| ·连接入pMD19-T载体 | 第47-48页 |
| ·蓝白斑筛选重组子 | 第48页 |
| ·挑取七个重组子提取质粒鉴定 | 第48-49页 |
| ·对质粒进行酶切鉴定 | 第49页 |
| ·重组子的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| ·重组质粒的测序结果 | 第50-51页 |
| ·引物分析 | 第51-53页 |
| 第五章 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
