| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 1 绪论 | 第11-24页 |
| ·生物农药的定义及前景 | 第11-14页 |
| ·微生物杀虫剂的特点 | 第12-13页 |
| ·绿僵菌在防治蝗灾中的优缺点与基因工程改造 | 第13-14页 |
| ·国内外研究昆虫神经毒素的历史与现状 | 第14-17页 |
| ·蝎昆虫神经毒素研究进展 | 第14-16页 |
| ·蜘蛛昆虫神经毒素研究进展 | 第16-17页 |
| ·各种表达系统的特点 | 第17-22页 |
| ·细菌（大肠杆菌）表达系统 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第18-19页 |
| ·哺乳动物细胞表达载体系统 | 第19-21页 |
| ·昆虫杆状病毒表达系统 | 第21-22页 |
| ·制备抗体的必要性 | 第22-23页 |
| ·供试昆虫的选择 | 第23-24页 |
| 2 毒素基因在大肠杆菌中的表达、纯化及抗血清的制备 | 第24-46页 |
| ·材料、设备及各种溶液的配方 | 第24-26页 |
| ·菌株、质粒及抗生素 | 第24页 |
| ·材料、试剂、各种溶液配方和培养基 | 第24-26页 |
| ·主要仪器设备 | 第26页 |
| ·实验方法 | 第26-34页 |
| ·昆虫神经毒素基因的扩增 | 第26-27页 |
| ·PCR 产物的回收 | 第27-28页 |
| ·表达载体pET-30a（+）小量抽提 | 第28页 |
| ·大肠杆菌表达载体的构建 | 第28页 |
| ·JM109 菌株及BL21（DE3）菌株电转化感受态细胞的制备 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌表达载体电转化JM109 菌株 | 第29页 |
| ·阳性转化子的筛选、测序并转化BL21（DE3）菌株 | 第29-30页 |
| ·诱导表达 | 第30-31页 |
| ·包涵体的提取 | 第31页 |
| ·融合蛋白的镍亲和纯化 | 第31页 |
| ·多克隆抗体的制备 | 第31-32页 |
| ·Western blotting 检测抗血清的特异性 | 第32-34页 |
| ·融合蛋白的活性分析 | 第34页 |
| ·结果与分析 | 第34-42页 |
| ·大肠杆菌融合表达转化子的检测 | 第34-36页 |
| ·大肠杆菌融合表达的SDS-PAGE 分析 | 第36-38页 |
| ·大肠杆菌融合表达的纯化 | 第38-40页 |
| ·抗体滴度的测定与提取血清 | 第40-41页 |
| ·抗体特异性验证 | 第41-42页 |
| ·活性分析 | 第42页 |
| ·讨论分析 | 第42-46页 |
| ·影响表达水平的主要因素 | 第42-44页 |
| ·包涵体提取 | 第44-45页 |
| ·多克隆抗体制备 | 第45页 |
| ·生物活性分析 | 第45-46页 |
| 3 抗BjαIT 毒素scFv 基因库的构建 | 第46-60页 |
| ·抗体的基本结构 | 第46-48页 |
| ·技术路线 | 第48页 |
| ·实验材料 | 第48-50页 |
| ·主要仪器 | 第48-49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·部分试剂配制 | 第49-50页 |
| ·方法与操作 | 第50-54页 |
| ·分离小鼠脾细胞 | 第50页 |
| ·提取脾细胞总RNA | 第50页 |
| ·VH、VL 及linker 的扩增 | 第50-54页 |
| ·结果与分析 | 第54-56页 |
| ·总RNA 提取及质量测定 | 第54页 |
| ·RT-PCR 扩增VH、VL | 第54-55页 |
| ·linker 的扩增 | 第55页 |
| ·全长片段的获取 | 第55-56页 |
| ·讨论与展望 | 第56-60页 |
| ·免疫小鼠 | 第56-57页 |
| ·总RNA 的提取 | 第57页 |
| ·重链和轻链的扩增 | 第57-58页 |
| ·重链和轻链的连接 | 第58-60页 |
| 4 蝎昆虫神经神经毒素在P. pastoris 中的表达 | 第60-84页 |
| ·材料、设备和各种溶液配方 | 第60-63页 |
| ·质粒、菌株及抗生素 | 第60页 |
| ·消耗材料及试剂、溶液和培养基配方 | 第60-62页 |
| ·主要仪器设备 | 第62-63页 |
| ·方法 | 第63-69页 |
| ·目的基因的设计 | 第63-65页 |
| ·酵母转化子的获取 | 第65-67页 |
| ·高水平表达菌株的筛选 | 第67-68页 |
| ·最佳收获时间的确定 | 第68页 |
| ·扩大诱导表达 | 第68页 |
| ·表达产物的Western-blotting 分析 | 第68-69页 |
| ·AaIT 表达产物的快速纯化 | 第69页 |
| ·表达产物的活性分析 | 第69页 |
| ·结果与分析 | 第69-80页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第69-71页 |
| ·高表达转化子的筛选 | 第71-72页 |
| ·高表达菌株的 SDS-PAGE 银染分析 | 第72-74页 |
| ·表达产物的Western blotting 分析 | 第74-75页 |
| ·最佳收获期的确定 | 第75-77页 |
| ·AaIT 的纯化及生物活性测定 | 第77-78页 |
| ·BjαIT 生物活性测定 | 第78页 |
| ·LqhIT2 生物活性测定 | 第78-80页 |
| ·讨论 | 第80-84页 |
| ·P. pastoris 表达系统的特点及其对表达的影响 | 第80-81页 |
| ·毒素在P. pastoris 中表达的影响因素 | 第81-83页 |
| ·重组昆虫神经毒素纯化及存在的问题 | 第83页 |
| ·生物活性分析 | 第83-84页 |
| 5 BjαIT 转化绿僵菌的初步研究 | 第84-91页 |
| ·材料、设备和各种溶液配方 | 第84-85页 |
| ·质粒、菌株及抗生素 | 第84页 |
| ·主要仪器设备 | 第84页 |
| ·主要试剂和培养基 | 第84-85页 |
| ·方法 | 第85-88页 |
| ·BjαIT 绿僵菌超表达分载体的构建 | 第85-86页 |
| ·超表达载体转化金龟子绿僵菌分生孢子 | 第86-87页 |
| ·转化子的除草剂初筛 | 第87页 |
| ·转化子的PCR 验证 | 第87-88页 |
| ·结果与分析 | 第88-90页 |
| ·超表达载体的构建和鉴定 | 第88-89页 |
| ·金龟子绿僵菌CQMa102 转化子的除草剂筛选 | 第89页 |
| ·转化子的PCR 验证 | 第89-90页 |
| ·讨论与展望 | 第90-91页 |
| 6 主要研究结论及后续工作建议 | 第91-92页 |
| ·主要研究结论 | 第91页 |
| ·后续工作建议 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-101页 |
| 附录 | 第101-103页 |
