| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-30页 |
| 1 CIA概况 | 第17页 |
| 2 CAV研究进展 | 第17-22页 |
| ·CAV及其基因组 | 第18页 |
| ·CAV基因组结构 | 第18页 |
| ·CAV基因组的转录 | 第18页 |
| ·CAV基因组编码蛋白及功能研究进展 | 第18-22页 |
| ·VP1蛋白 | 第19-20页 |
| ·VP2蛋白 | 第20页 |
| ·VP3蛋白(凋亡素) | 第20-22页 |
| 3 CAV感染性分子克隆研究进展 | 第22-23页 |
| 4 CAV抗原表位及单克隆抗体研究进展 | 第23-26页 |
| ·CAV抗原表位研究 | 第23-26页 |
| ·CAV抗原表位研究 | 第23-24页 |
| ·抗原表位研究方法 | 第24-26页 |
| ·CAV单克隆抗体研究进展 | 第26页 |
| 5 CIA诊断方法及疫苗研究进展 | 第26-29页 |
| ·CIA诊断方法研究进展 | 第26-27页 |
| ·血清学检测 | 第27页 |
| ·分子生物学方法 | 第27页 |
| ·CIA疫苗研究进展 | 第27-29页 |
| ·传统疫苗 | 第28页 |
| ·基因工程疫苗 | 第28-29页 |
| 6 本研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 第二章 CAV VP1蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位初步鉴定 | 第30-43页 |
| 1 材料与方法 | 第30-35页 |
| ·毒株、质粒、菌株、细胞 | 第30-31页 |
| ·主要试剂与药品 | 第31页 |
| ·实验动物 | 第31页 |
| ·仪器设备 | 第31页 |
| ·CAV vp1基因的分段克隆与表达 | 第31-33页 |
| ·vp1基因抗原表位的预测及引物设计 | 第31-32页 |
| ·vp1基因各片段的获得 | 第32页 |
| ·分段基因融合表达载体的构建 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的原核表达与纯化 | 第33页 |
| ·重组蛋白的Dot-ELISA检测 | 第33页 |
| ·CAV VP1蛋白单克隆抗体的制备 | 第33-35页 |
| ·动物免疫 | 第33页 |
| ·细胞融合 | 第33-34页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的筛选与纯化 | 第34页 |
| ·单克隆抗体的特异性鉴定 | 第34页 |
| ·单克隆抗体亚型的鉴定 | 第34-35页 |
| ·CAV VP1蛋白单克隆抗体抗原表位的初步定位 | 第35页 |
| 2 结果 | 第35-41页 |
| ·CAV VP1蛋白抗原表位预测 | 第35-36页 |
| ·vp1基因的分段表达与鉴定 | 第36-38页 |
| ·vp1基因分段表达载体的构建 | 第36-37页 |
| ·vp1基因的分段表达 | 第37页 |
| ·重组蛋白Dot-ELISA检测 | 第37-38页 |
| ·VP1蛋白单克隆抗体的制备 | 第38-40页 |
| ·免疫原的制备 | 第38页 |
| ·阳性细胞克隆株的筛选及纯化 | 第38页 |
| ·间接免疫荧光试验(Immunofluorescence assay IFA) | 第38-39页 |
| ·单克隆抗体与真核表达的VP1蛋白的Western blot分析 | 第39-40页 |
| ·单克隆抗体亚型的鉴定 | 第40页 |
| ·VP1蛋白单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 | 第40-41页 |
| 3 讨论 | 第41-43页 |
| 第三章 利用噬菌体展示结合肽扫描技术研究CAV VP1蛋白抗原表位 | 第43-63页 |
| 1 材料与方法 | 第43-52页 |
| ·菌株、质粒、血清 | 第43-44页 |
| ·主要试剂与药品 | 第44页 |
| ·主要溶液的配制 | 第44-45页 |
| ·噬菌体载体fUSE Ⅰ与vp1基因的处理 | 第45-46页 |
| ·噬菌体载体fUSE Ⅰ的制备 | 第45页 |
| ·CAV vp1基因随机片段的制备 | 第45-46页 |
| ·vp1基因特异性噬菌体展示肽库的构建 | 第46-47页 |
| ·电转化感受态细胞的制备 | 第46页 |
| ·fUSE Ⅰ载体与vp1基因随机片段的连接、转化 | 第46页 |
| ·vp1基因特异性噬菌体展示肽库的纯化 | 第46-47页 |
| ·vp1基因特异性肽库质量的测定 | 第47页 |
| ·vp1基因特异性肽库库容量的测定 | 第47页 |
| ·vp1基因特异性肽库随机性测定 | 第47页 |
| ·vp1基因特异性肽库的淘选(Biopanning) | 第47-48页 |
| ·K91BK饥饿细胞的制备 | 第47页 |
| ·TB(Terrific Broth Cultures)培养基的制备 | 第47-48页 |
| ·肽库滴定 | 第48页 |
| ·第一轮淘选 | 第48页 |
| ·噬菌体的第2、3轮淘选 | 第48页 |
| ·噬菌体ELISA | 第48-49页 |
| ·噬菌体阳性克隆的序列测定 | 第49页 |
| ·竞争抑制试验 | 第49页 |
| ·阳性噬菌体与抗VP1蛋白单克隆抗体的Western blot分析 | 第49页 |
| ·VP1蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定 | 第49-52页 |
| ·vp1基因一系列短肽的设计 | 第50-51页 |
| ·短肽的融合表达 | 第51-52页 |
| ·单克隆抗体识别的表位的鉴定 | 第52页 |
| 2 结果 | 第52-60页 |
| ·CAV vp1基因噬菌体特异性展示肽库的构建 | 第52-53页 |
| ·vp1基因随机片段及fUSE Ⅰ载体的制备 | 第52页 |
| ·vp1基因特异性肽库库容量的测定 | 第52页 |
| ·vp1基因特异性肽库随机性的测定 | 第52-53页 |
| ·阳性噬菌体的鉴定 | 第53-56页 |
| ·噬菌体ELISA | 第53-54页 |
| ·表位序列的测定 | 第54-55页 |
| ·竞争抑制试验 | 第55-56页 |
| ·阳性噬菌体与单克隆抗体的Western blot分析 | 第56页 |
| ·单克隆抗体4D5和2F3识别表位的精确定位 | 第56-60页 |
| ·单克隆抗体4D5对应的抗原表位的精确定位 | 第56-58页 |
| ·单克隆抗体2F3/1C5/4D2/4E8对应的抗原表位的精确定位 | 第58-60页 |
| 3.讨论 | 第60-63页 |
| 第四章 应用肽扫描方法对CAV VP2蛋白进行抗原表位作图 | 第63-78页 |
| 1 材料与方法 | 第63-69页 |
| ·毒株、质粒、菌株和细胞 | 第63页 |
| ·酶与标记物 | 第63-64页 |
| ·CAV vp2基因的克隆与表达 | 第64-65页 |
| ·vp2基因的获取 | 第64页 |
| ·vp2基因表达载体的构建 | 第64页 |
| ·VP2蛋白的表达与纯化 | 第64页 |
| ·重组VP2蛋白的Western blot分析 | 第64-65页 |
| ·CAV VP2蛋白单克隆抗体的制备 | 第65-66页 |
| ·免疫原的制备 | 第65页 |
| ·动物免疫 | 第65页 |
| ·细胞融合 | 第65页 |
| ·阳性杂交瘤细胞的筛选与纯化 | 第65页 |
| ·单克隆抗体特异性鉴定 | 第65-66页 |
| ·VP2蛋白抗原表位预测分析 | 第66页 |
| ·CAV VP2蛋白的抗原表位作图(epitope mapping) | 第66-68页 |
| ·表达覆盖VP2蛋白全长的系列短肽的设计 | 第66-67页 |
| ·短肽的融合表达 | 第67页 |
| ·免疫印迹试验(Western blot) | 第67-68页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA) | 第68页 |
| ·鼠抗表位融合蛋白血清的制备 | 第68页 |
| ·检测抗融合蛋白血清与CAV的免疫反应性 | 第68-69页 |
| ·融合蛋白抗血清与真核表达VP2蛋白的免疫反应性 | 第69页 |
| 2 结果 | 第69-76页 |
| ·vp2基因表达载体的构建 | 第69页 |
| ·vp2基因的表达及Westem blot分析 | 第69-70页 |
| ·VP2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 | 第70-71页 |
| ·VP2蛋白的抗原表位作图 | 第71-75页 |
| ·融合表达质粒的构建 | 第71-72页 |
| ·21段融合短肽的表达 | 第72-74页 |
| ·VP2蛋白抗原表位作图 | 第74-75页 |
| ·鼠抗表位融合蛋白血清的制备 | 第75-76页 |
| ·免疫用抗原的纯化 | 第75页 |
| ·抗表位血清的检测 | 第75-76页 |
| 3 讨论 | 第76-78页 |
| 第五章 CAV感染性分子克隆及其突变体的构建 | 第78-92页 |
| 1 材料与方法 | 第78-82页 |
| ·毒株、载体和细胞 | 第78-79页 |
| ·主要试剂 | 第79页 |
| ·引物设计与合成 | 第79-80页 |
| ·重组质粒pBluem2CAV的构建和鉴定 | 第80页 |
| ·CAV全长基因组的获取 | 第80页 |
| ·重组质粒pBluemCAV的构建与鉴定 | 第80页 |
| ·重组质粒pBluem2CAV的构建与鉴定 | 第80页 |
| ·pBluem2CAV转染MDCC-MSB1细胞及鉴定 | 第80-81页 |
| ·pBluem2CAV电转染MDCC-MSB1细胞 | 第80页 |
| ·间接免疫荧光检测(Immunofluorence assay IFA) | 第80-81页 |
| ·PCR检测分子标签 | 第81页 |
| ·vp3基因缺失病毒的拯救 | 第81页 |
| ·pBluemCAVVP3~-/pBluemCAVNLS2~-的构建与鉴定 | 第81页 |
| ·pBluem2CAVVP3~-/pBluem2CAVNLS2~-的构建与鉴定 | 第81页 |
| ·pBluem2CAVVP3~-/pBluem2CAVNLS2~-的转染与鉴定 | 第81页 |
| ·动物试验 | 第81-82页 |
| 2 结果 | 第82-89页 |
| ·CAV全长基因组获取 | 第82页 |
| ·重组质粒pBluemCAV的鉴定 | 第82-83页 |
| ·重组质粒pBluem2CAV的构建和鉴定 | 第83页 |
| ·pBluem2CAV转染后的检测 | 第83-85页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)检测 | 第83-84页 |
| ·pBluem2CAV转染后的分子标签检测 | 第84-85页 |
| ·重组毒pBluem2CAVVP3~-/pBluem2CAVNLS2~构建 | 第85-86页 |
| ·重组毒pBluem2CAVVP3~-/pBluem2CAVNLS2~-转染后鉴定 | 第86-87页 |
| ·间接免疫荧光检测 | 第86页 |
| ·pBluem2CAVVP3~-/pBluem2CAVNLS2~-转染后分子标签检测 | 第86-87页 |
| ·动物试验 | 第87-89页 |
| ·病理学检测 | 第87-89页 |
| ·PCR检测 | 第89页 |
| 3.讨论 | 第89-92页 |
| 第六章 结论 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 作者简历 | 第104页 |
