| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 目录 | 第10-14页 |
| 英文缩略词 | 第14-15页 |
| 第一部分 文献综述 抗冻蛋白研究进展 | 第15-30页 |
| 1 不同抗冻蛋白的结构类型 | 第15-19页 |
| ·鱼类抗冻蛋白 | 第15-17页 |
| ·抗冻糖蛋白(AFGPs) | 第15-16页 |
| ·Ⅰ型抗冻蛋白(AFPⅠ) | 第16页 |
| ·Ⅱ型抗冻蛋白(AFPⅡ) | 第16-17页 |
| ·Ⅲ型抗冻蛋白(AFPⅢ) | 第17页 |
| ·Ⅳ型抗冻蛋白(AFPⅣ) | 第17页 |
| ·植物抗冻蛋白 | 第17-18页 |
| ·昆虫抗冻蛋白 | 第18-19页 |
| ·其他抗冻蛋白 | 第19页 |
| 2 抗冻蛋白性质特征 | 第19-20页 |
| ·热滞效应 | 第19-20页 |
| ·冰晶形态效应 | 第20页 |
| ·重结晶抑制效应 | 第20页 |
| 3 抗冻蛋白的基因工程表达 | 第20-22页 |
| ·抗冻蛋白的原核表达 | 第20-21页 |
| ·抗冻蛋白真核表达 | 第21-22页 |
| 4 抗冻蛋白应用 | 第22-25页 |
| ·农业应用 | 第22-23页 |
| ·医学应用 | 第23页 |
| ·食品应用 | 第23-24页 |
| ·工业应用 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-30页 |
| 第二部分 实验部分 | 第30-91页 |
| 第一章 巴斯德毕赤酵母表达小胸鳖甲抗冻蛋白 | 第30-50页 |
| 1 实验材料 | 第31-32页 |
| ·菌种和质粒 | 第31页 |
| ·工具酶及其它试剂 | 第31页 |
| ·PCR引物 | 第31页 |
| ·主要实验仪器 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-43页 |
| ·质粒PGEX-4T-1-MPAFP698及PPIC9K的提取鉴定及目的基因获得 | 第32-35页 |
| ·质粒pGEX-1-Mpafp698的小量提取 | 第32页 |
| ·酶切鉴定pGEX-4T-1-Mpafp698及目的片段的回收 | 第32-33页 |
| ·质粒pPIC9K的提取鉴定及定量 | 第33-35页 |
| ·重组质粒PPIC9K-MPAFP698的构建 | 第35-36页 |
| ·载体pPIC9K与目的基因Mpafp698连接 | 第35页 |
| ·连接产物转化E.coli TOP10 F'感受态细胞 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pPIC9K Mpafp698的小量提取及酶切鉴定 | 第36页 |
| ·PICHIA PASTORIS GS115感受态细胞的制备 | 第36-37页 |
| ·重组表达载体PPIC9K-MPAFP698线性化 | 第37页 |
| ·线性化重组子电转化毕赤酵母 | 第37页 |
| ·酵母基因组的提取 | 第37-38页 |
| ·PCR表性鉴定 | 第38-40页 |
| ·利用PCR扩增目的基因片断 | 第38-39页 |
| ·利用PCR的方法鉴定重组子表型 | 第39-40页 |
| ·MUT+重组酵母菌MPAFP698的诱导表达及纯化 | 第40-41页 |
| ·Mut+重组酵母菌MpAFP698的诱导表达 | 第40页 |
| ·TCA法浓缩纯化酵母表达的MpAFP698 | 第40页 |
| ·Tricine SDS-PAGE电泳 | 第40-41页 |
| ·WESTERN BLOTTING分析 | 第41-43页 |
| ·酵母表达抗冻蛋白结构分析 | 第43页 |
| ·糖基化修饰 | 第43页 |
| ·脂质化修饰 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-48页 |
| ·PGEX-4T-1-MPAFP698和PPIC9K质粒酶切鉴定 | 第43-44页 |
| ·PPIC9K和MPAFP698酶切回收鉴定 | 第44页 |
| ·重组质粒PPIC9K MPAFP698的提取及酶切鉴定 | 第44-45页 |
| ·PPIC9K MPAFP698电转化毕赤酵母 | 第45页 |
| ·重组子表型PCR鉴定 | 第45-46页 |
| ·发酵上清液TRICINE SDS-PAGE电泳检测 | 第46-47页 |
| ·WESTERN BLOTTING分析 | 第47页 |
| ·酵母表达抗冻蛋白结构分析 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| 第二章 真核表达MPAFP698的活性研究 | 第50-67页 |
| 1 实验材料 | 第50-51页 |
| ·菌种及质粒 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50页 |
| ·主要设备 | 第50-51页 |
| 2 实验方法 | 第51-54页 |
| ·PPIC9K MPAFP698阳性转化子筛选 | 第51页 |
| ·G418抗性筛选HIS+高拷贝转化子 | 第51页 |
| ·蛋白表达水平检测 | 第51-52页 |
| ·酵母菌生长曲线的测定及绘制 | 第52页 |
| ·诱导时间对重组抗冻蛋白表达量的影响 | 第52页 |
| ·MPAFP698蛋白浓度与拷贝数,THA,SCP及冰点的相关性分析 | 第52-53页 |
| ·MpAFP698浓度测定 | 第52页 |
| ·MpAFP698的THA活性测定 | 第52-53页 |
| ·MpAFP698过冷却点及冰点测定 | 第53页 |
| ·相关性分析 | 第53页 |
| ·AFP耐热性检验 | 第53页 |
| ·AFP耐酸碱性检验 | 第53-54页 |
| ·表达宿主酵母菌的低温存活检测 | 第54页 |
| ·体外对菌体的低温及高温保护作用分析 | 第54页 |
| 3 实验结果及分析 | 第54-64页 |
| ·PPIC9K MPAFP698阳性转化子筛选 | 第54-55页 |
| ·6418筛选高拷贝转化子 | 第55-56页 |
| ·MPAFP698蛋白浓度与拷贝数,THA,SCP及冰点的相关性分析 | 第56-60页 |
| ·MpAFP698浓度测定 | 第56页 |
| ·MpAFP698的THA测定 | 第56-57页 |
| ·MpAFP698蛋白浓度,拷贝数,THA,SCP及冰点的相关性分析 | 第57-59页 |
| ·高拷贝抗冻蛋白菌株UV3010全波长扫描检测 | 第59-60页 |
| ·MPAFP698热稳定分析 | 第60-61页 |
| ·MPAFP698耐酸碱性检验 | 第61-62页 |
| ·表达MPAFP698宿主酵母菌的低温存活检测 | 第62-63页 |
| ·体外添加MPAFP698对菌体的低温及高温保护作用分析 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 第三章 MPAFP698巴斯德毕赤酵母表达条件优化 | 第67-76页 |
| 1 实验材料 | 第67-68页 |
| ·实验试剂及材料 | 第67页 |
| ·主要实验仪器 | 第67-68页 |
| 2 实验方法 | 第68-69页 |
| ·抗冻蛋白活性测定方法 | 第68页 |
| ·摇瓶培养 | 第68页 |
| ·生长曲线的测定 | 第68-69页 |
| ·小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP698)发酵条件优化 | 第69页 |
| 3 实验结果及分析 | 第69-71页 |
| ·生长曲线测定 | 第69-70页 |
| ·小胸鳖甲抗冻蛋白(MPAFP698)发酵条件优化 | 第70-71页 |
| ·接种温度的影响 | 第70页 |
| ·诱导时间的影响 | 第70-71页 |
| ·甲醇浓度对抗冻蛋白活性的影响 | 第71页 |
| 4 讨论 | 第71-74页 |
| 参考文献 | 第74-76页 |
| 第四章 小胸鳖甲抗冻蛋白MPAFP698的应用研究 | 第76-91页 |
| 1 实验材料 | 第77页 |
| 2 实验方法 | 第77-81页 |
| ·MPAFP698对SF9细胞低温保存的影响 | 第77-80页 |
| ·细胞冻存与复苏 | 第77-78页 |
| ·细胞计数及显微照相 | 第78-79页 |
| ·电导率测定 | 第79页 |
| ·MTT检测 | 第79-80页 |
| ·MPAFP698对小鼠血细胞低温保存的影响 | 第80页 |
| ·MPAFP698对小鼠器官冷冻保存的影响 | 第80-81页 |
| ·解剖小鼠 | 第80页 |
| ·小鼠器官石蜡切片的制作及观察 | 第80-81页 |
| ·MPAFP698对葡萄的低温保存影响 | 第81页 |
| 3 实验结果及分析 | 第81-88页 |
| ·MPAFP698对SF9细胞低温保存的影响 | 第81-84页 |
| ·细胞计数 | 第82页 |
| ·细胞显微形态观察 | 第82-83页 |
| ·电导率测定 | 第83页 |
| ·MTT检测 | 第83-84页 |
| ·MPAFP698对小鼠血细胞低温保存的影响 | 第84页 |
| ·MPAFP698对小鼠器官冷冻保存的影响 | 第84-86页 |
| ·MPAFP698对葡萄的低温保存影响 | 第86-88页 |
| 4 讨论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-91页 |
| 第三部分 结论与展望 | 第91-92页 |
| 第四部分 附录 | 第92-99页 |
| 附录一 常用仪器设备 | 第92-93页 |
| 附录二 常用试剂配制方法 | 第93-98页 |
| 附录三 个人简历 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99页 |
