| 摘要 | 第1-9页 |
| 中文摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 一 前言 | 第9-15页 |
| （一） TNF的发现 | 第9页 |
| （二） 人肿瘤坏死因子的基因结构和蛋白质分子结构 | 第9-10页 |
| （三） TNF基因的表达和调控 | 第10-11页 |
| （四） TNF的制备方法 | 第11页 |
| （五） hTNF-α的生物功能和作用机制 | 第11-13页 |
| （六） TNF的检测方法 | 第13-14页 |
| （七） TNF的应用 | 第14-15页 |
| 二 材料和方法 | 第15-29页 |
| （一） 主要仪器 | 第15页 |
| （二） 实验材料 | 第15-18页 |
| 2．1 质粒和菌种 | 第15-16页 |
| 2．2 细胞株 | 第16页 |
| 2．3 主要试剂 | 第16页 |
| 2．4 其他试剂 | 第16-18页 |
| （三） 技术路线 | 第18-20页 |
| （四） 实验方法 | 第20-29页 |
| 4．1 碱裂解法抽提质粒DNA | 第20页 |
| 4．2 质粒DNA的乙醇法浓缩 | 第20-21页 |
| 4．3 引物设计和PCR扩增 | 第21页 |
| 4．4 质粒DNA的限制性内切酶酶切 | 第21页 |
| 4．5 质粒酶切产物的去磷酸化处理 | 第21-22页 |
| 4．6 DNA连接反应 | 第22页 |
| 4．7 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第22页 |
| 4．8 重组DNA的转化 | 第22-23页 |
| 4．9 重组质粒的鉴定 | 第23页 |
| 4．10 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第23-25页 |
| 4．11 western-blotting实验 | 第25-27页 |
| 4．12 表达产物的体外细胞毒实验 | 第27页 |
| 4．13 表达产物的纯化 | 第27-29页 |
| 三 结果与分析 | 第29-40页 |
| （一） pTrcHis2A-hTNF-α表达质粒的构建与鉴定 | 第29-33页 |
| 1．1 表达载体的选择 | 第29页 |
| 1．2 pTrcHis2A质粒的鉴定 | 第29-30页 |
| 1．3 hTNF-α基因cDNA的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 1．4 重组基因的构建和鉴定 | 第31-33页 |
| 1．4．1 重组基因的构建 | 第31页 |
| 1．4．2 重组基因的鉴定 | 第31-33页 |
| （二） 重组基因表达产物的鉴定 | 第33-35页 |
| 2．1 SDS-PAGE测定表达产物的分子量 | 第33页 |
| 2．2 western-blotting实验 | 第33-34页 |
| 2．3 体外细胞毒实验 | 第34-35页 |
| （三） 基因工程菌hTNF-α的生产和纯化 | 第35-40页 |
| 3．1 hTNF-α的制备 | 第35-37页 |
| 3．1．1 hTNF-α的诱导表达 | 第35-36页 |
| 3．1．1．1 IPTG的浓度对表达的影响 | 第35页 |
| 3．1．1．2 诱导时间对表达的影响 | 第35-36页 |
| 3．1．2 不同宿主菌对重组蛋白表达的影响 | 第36-37页 |
| 3．2 表达产物的纯化 | 第37-40页 |
| 3．2．1 离子交换层析 | 第37-38页 |
| 3．2．2 亲和层析 | 第38-40页 |
| 四 讨论 | 第40-46页 |
| 五 结论与展望 | 第46-47页 |
| 六 附录 | 第47-58页 |
| （一） 略词中英文对照 | 第47-48页 |
| （二） 参考文献 | 第48-53页 |
| （三） hTNF-α的基因序列 | 第53-56页 |
| （四） hTNF-α的基因序列 | 第56-58页 |
| （五） 在学期间发表的论文和致谢 | 第58页 |