| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-7页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 第一章 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 铜绿假单胞菌简介 | 第12-15页 |
| 1.1.1 铜绿假单胞菌简述 | 第12页 |
| 1.1.2 铜绿假单胞菌引起的感染 | 第12-13页 |
| 1.1.3 铜绿假单胞菌中的群体感应现象 | 第13-14页 |
| 1.1.4 铜绿假单胞菌的生物膜形成 | 第14页 |
| 1.1.5 活性氧自由基(ROS)的产生 | 第14页 |
| 1.1.6 铜绿假单胞菌的致病机理 | 第14-15页 |
| 1.2 铜绿假单胞菌锌离子摄取的研究进展 | 第15-20页 |
| 1.2.1 锌离子在菌体中的作用 | 第15页 |
| 1.2.2 细菌中金属离子的摄取 | 第15-17页 |
| 1.2.3 细菌中锌离子摄取系统的研究 | 第17-20页 |
| 1.3 本研究的内容和意义 | 第20-21页 |
| 1.4 本研究的技术路线 | 第21-22页 |
| 第二章 载体和菌株的构建 | 第22-47页 |
| 2.1 引言 | 第22页 |
| 2.2 材料和方法 | 第22-36页 |
| 2.2.1 试剂 | 第22-23页 |
| 2.2.2 培养条件 | 第23页 |
| 2.2.3 菌株和质粒 | 第23-26页 |
| 2.2.4 引物 | 第26-28页 |
| 2.2.5 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.2.6 细菌总DNA提取 | 第29-30页 |
| 2.2.7 细菌内质粒的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.8 PCR反应 | 第31页 |
| 2.2.9 重叠延伸PCR | 第31-32页 |
| 2.2.10 DNA纯化回收 | 第32页 |
| 2.2.11 酶切反应 | 第32-33页 |
| 2.2.12 连接反应 | 第33页 |
| 2.2.13 大肠杆菌的感受态的制备以及热激转化 | 第33-34页 |
| 2.2.14 铜绿假单胞菌的电击转化 | 第34页 |
| 2.2.15 质粒接合转移 | 第34-35页 |
| 2.2.16 基因敲除及互补 | 第35页 |
| 2.2.17 染色体融合报告菌株的构建 | 第35-36页 |
| 2.2.18 菌体中Tc抗性基因的去除 | 第36页 |
| 2.3 结果与分析 | 第36-46页 |
| 2.3.1 同源重组的原理 | 第36-37页 |
| 2.3.2 双亲本杂交原理 | 第37页 |
| 2.3.3 PCR扩增cntR、cntL、cntN、cntRL、zur的同源突变片段 | 第37-39页 |
| 2.3.4 突变载体中连接抗性基因Gm | 第39页 |
| 2.3.5 双亲本杂交构建目的突变株 | 第39-40页 |
| 2.3.6 利用pK18mobSacB蔗糖自杀特点获得目的突变株 | 第40-41页 |
| 2.3.7 遗传互补载体的构建 | 第41-43页 |
| 2.3.8 通过电转化的方法获得遗传互补菌株 | 第43-44页 |
| 2.3.9 转录融合报告载体的构建 | 第44-45页 |
| 2.3.10 转录融合报告菌株的构建 | 第45-46页 |
| 2.3.11 去除Tc抗性基因的转录融合报告菌株 | 第46页 |
| 2.4 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 铜绿假单胞菌cnt操纵子的功能分析 | 第47-69页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 材料和方法 | 第47-55页 |
| 3.2.1 主要试剂和配方 | 第47-48页 |
| 3.2.2 菌种和质粒 | 第48-50页 |
| 3.2.3 引物 | 第50页 |
| 3.2.4 仪器 | 第50页 |
| 3.2.5 PCR、酶切、纯化、连接、转化 | 第50页 |
| 3.2.6 蛋白的异源表达的可溶性检测 | 第50-51页 |
| 3.2.7 蛋白的异源表达的纯化回收 | 第51-52页 |
| 3.2.8 透析袋的活化 | 第52页 |
| 3.2.9 β-半乳糖苷酶活性的测定 | 第52-53页 |
| 3.2.10 Native-PAGE中纯化回收DNA片段 | 第53-54页 |
| 3.2.11 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第54页 |
| 3.2.12 cntL控制合成的锌载体的提取 | 第54页 |
| 3.2.13 生长曲线 | 第54-55页 |
| 3.2.14 大蜡螟幼虫的致死实验 | 第55页 |
| 3.2.15 统计分析 | 第55页 |
| 3.3 结果与分析 | 第55-68页 |
| 3.3.1 Zur蛋白调节控制cnt操纵子 | 第55-57页 |
| 3.3.2 Zur蛋白的表达和纯化 | 第57-58页 |
| 3.3.3 Zur蛋白与cnt启动子的体外结合 | 第58-60页 |
| 3.3.4 cnt操纵子参与锌离子的摄取 | 第60-62页 |
| 3.3.5 CntR作为受体参与锌离子的摄取 | 第62-64页 |
| 3.3.6 CntN作为转运蛋白参与锌离子的摄取 | 第64-65页 |
| 3.3.7 自身基因的突变不影响cnt操纵子的表达 | 第65-66页 |
| 3.3.8 cnt操纵子对其它金属的作用 | 第66-67页 |
| 3.3.9 cnt操纵子影响铜绿假单胞菌对大蜡螟幼虫的毒力 | 第67-68页 |
| 3.4 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 结论与讨论 | 第69-73页 |
| 4.1 结论 | 第69-71页 |
| 4.2 讨论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第82页 |
