| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第9-10页 |
| 综述一：端粒酶介导的细胞永生化研究进展 | 第10-21页 |
| 1 猪成纤维细胞的分离培养 | 第10-13页 |
| 1.1 猪成纤维细胞的特点 | 第10-11页 |
| 1.2 猪成纤维细胞的培养方法 | 第11-12页 |
| 1.3 纯化方法 | 第12-13页 |
| 2 端粒酶介导的细胞永生化研究进展 | 第13-18页 |
| 2.1 端粒 | 第14页 |
| 2.2 端粒酶 | 第14-17页 |
| 2.2.1 端粒酶RNA | 第15页 |
| 2.2.2 端粒酶相关蛋白 | 第15-16页 |
| 2.2.3 端粒酶逆转录酶 | 第16-17页 |
| 2.3 端粒与细胞衰老、永生化的关系 | 第17-18页 |
| 2.5 细胞永生化的意义 | 第18页 |
| 参考文献 | 第18-21页 |
| 综述二：SB转座子作为基因转移载体的研究进展 | 第21-27页 |
| 1. SB转座子的结构 | 第21-22页 |
| 2. SB转座机制 | 第22-23页 |
| 3. SB转座子作为基因转移载体的优势 | 第23-24页 |
| 4. SB转座子的应用与展望 | 第24-25页 |
| 参考文献 | 第25-27页 |
| 研究内容一：表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及鉴定 | 第27-45页 |
| 摘要 | 第27页 |
| 1 材料 | 第27-28页 |
| 1.1 主要试剂、质粒、细胞和菌株 | 第27-28页 |
| 1.2 主要试剂配制 | 第28页 |
| 1.3 主要仪器 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-37页 |
| 2.1 细胞基因组的提取 | 第28-29页 |
| 2.2 细胞RNA提取 | 第29-30页 |
| 2.3 反转录反应 | 第30-31页 |
| 2.4 报告载体构建 | 第31-35页 |
| 2.4.1 PCR扩增目的基因 | 第31-33页 |
| 2.4.2 PCR产物测序 | 第33页 |
| 2.4.3 目的片段与载体连接 | 第33-35页 |
| 2.5 猪EF-1a启动子的转录活性检测 | 第35-36页 |
| 2.6 转座子介导报告基因整合检测 | 第36页 |
| 2.7 猪TERT转座子载体的构建 | 第36-37页 |
| 2.7.1 cDNA的RT-PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.7.2 载体与目的片段连接 | 第37页 |
| 3 结果 | 第37-42页 |
| 3.1 报告载体的构建 | 第37-39页 |
| 3.1.1 PCR扩增目的片段 | 第37-39页 |
| 3.1.2 载体的酶切鉴定 | 第39页 |
| 3.2 细胞基因转染与荧光显微镜观察 | 第39-40页 |
| 3.3 转座子介导的报告基因整合效率检测 | 第40-41页 |
| 3.4 转座子载体的构建与鉴定 | 第41-42页 |
| 3.4.1 猪TERT eDNA扩增与测序鉴定 | 第41-42页 |
| 4 讨论与小结 | 第42-44页 |
| 参考文献 | 第44-45页 |
| 研究内容二：表达猪端粒酶反转录酶转座子在猪源细胞永生化中的应用 | 第45-65页 |
| 摘要 | 第45页 |
| 1 材料 | 第45-47页 |
| 1.1 实验动物、细胞与毒株 | 第45页 |
| 1.2 主要试剂、质粒和菌株 | 第45-46页 |
| 1.3 主要试剂配制 | 第46页 |
| 1.4 主要仪器 | 第46-47页 |
| 2 方法 | 第47-54页 |
| 2.1 猪肾成纤维细胞分离培养 | 第47-48页 |
| 2.1.1 猪肾的分离 | 第47页 |
| 2.1.2 猪肾成纤维细胞分离 | 第47-48页 |
| 2.2 细胞转染与阳性克隆筛选 | 第48-49页 |
| 2.2.1 无内毒素质粒提取 | 第48-49页 |
| 2.2.2 细胞转染(方法同2.5) | 第49页 |
| 2.2.3 筛选及阳性克隆获得 | 第49页 |
| 2.3 转染细胞生长特性测定 | 第49-54页 |
| 2.3.1 生长曲线和群体倍增时间 | 第49-50页 |
| 2.3.2 克隆形成效率 | 第50页 |
| 2.3.3 FACS检测细胞生长周期 | 第50-51页 |
| 2.3.4 细胞形态学观察 | 第51页 |
| 2.3.5 RT-PCR检测细胞标志与TERT表达 | 第51页 |
| 2.3.6 ELISA检测猪端粒逆转录酶活性 | 第51-52页 |
| 2.3.7 细胞病毒易感性 | 第52-53页 |
| 2.3.8 致瘤性检测 | 第53页 |
| 2.3.9 支原体污染检测 | 第53-54页 |
| 3 结果 | 第54-62页 |
| 3.1 猪肾成纤维细胞形态特征 | 第54页 |
| 3.2 阳性克隆的获得 | 第54-55页 |
| 3.3 转染细胞生长特性 | 第55-62页 |
| 3.3.1 细胞生长曲线、群体倍增时间及克隆形成率 | 第55-56页 |
| 3.3.2 FACS检测细胞生长周期 | 第56-57页 |
| 3.3.3 细胞形态观察 | 第57-58页 |
| 3.3.4 细胞标志检测 | 第58-59页 |
| 3.3.5 端粒酶及其活性检测 | 第59-60页 |
| 3.3.6 肿瘤形成力检测 | 第60页 |
| 3.3.7 细胞病毒易感性 | 第60-61页 |
| 3.3.8 细胞支原体检测 | 第61-62页 |
| 4 讨论与小结 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-65页 |
| 附录 | 第65-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
