| 符号说明 | 第4-8页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 1 前言 | 第12-22页 |
| 1.1 嗜热真菌的概述 | 第12-13页 |
| 1.1.1 嗜热真菌的定义及自然界分布 | 第12页 |
| 1.1.2 嗜热真菌的研究意义 | 第12-13页 |
| 1.2 纤维素的概述 | 第13-15页 |
| 1.2.1 纤维素的结构 | 第13-14页 |
| 1.2.2 纤维素的来源 | 第14页 |
| 1.2.3 纤维素的应用 | 第14-15页 |
| 1.3 纤维素酶的概述 | 第15-16页 |
| 1.3.1 纤维素酶的定义 | 第15页 |
| 1.3.2 纤维素酶的分类 | 第15-16页 |
| 1.3.3 纤维素酶的分子改造 | 第16页 |
| 1.4 同源建模在纤维素酶分子改造中的应用 | 第16-17页 |
| 1.4.1 进行家族同源分析 | 第17页 |
| 1.4.2 纤维素酶分子结构与功能关系的分析 | 第17页 |
| 1.4.3 基于分子结构的理性设计 | 第17页 |
| 1.4.4 预测突变体的结构与新功能 | 第17页 |
| 1.4.5 同源建模与其他分子模拟技术相结合 | 第17页 |
| 1.5 纤维素酶的研究进展 | 第17-20页 |
| 1.5.1 对外切葡聚糖酶进行分子改造的研究进展 | 第17-18页 |
| 1.5.2 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受机制的研究 | 第18-19页 |
| 1.5.3 关于第十二家族糖苷水解酶的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.6 立题依据和技术路线 | 第20-22页 |
| 1.6.1 立题依据 | 第20-21页 |
| 1.6.2 技术路线 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 酶、生化试剂和试剂盒 | 第22页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第22-23页 |
| 2.1.4 溶液和培养基的配制 | 第23-25页 |
| 2.1.4.1 溶液 | 第23-24页 |
| 2.1.4.2 培养基 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-41页 |
| 2.2.1 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶野生型基因的真核表达 | 第25-35页 |
| 2.2.1.1 steg1基因的克隆 | 第25-26页 |
| 2.2.1.2 原酶STEG1酵母工程菌的获得 | 第26-32页 |
| 2.2.1.3 原酶STEG1的诱导表达与纯化 | 第32-35页 |
| 2.2.2 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1突变体的真核表达 | 第35-37页 |
| 2.2.2.1 STEG1突变体的获得 | 第35-37页 |
| 2.2.2.2 STEG1突变体酵母工程菌的获得 | 第37页 |
| 2.2.2.3 突变酶的诱导表达纯化 | 第37页 |
| 2.2.3 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶性质的测定 | 第37-40页 |
| 2.2.3.1 蛋白的浓度测定 | 第37-38页 |
| 2.2.3.2 绘制DNS标准曲线 | 第38-39页 |
| 2.2.3.3 蛋白最适温度的测定 | 第39页 |
| 2.2.3.4 蛋白最适pH的测定 | 第39页 |
| 2.2.3.5 蛋白热稳定性的测定 | 第39-40页 |
| 2.2.3.6 蛋白比活力的测定 | 第40页 |
| 2.2.3.7 蛋白动力学参数的测定 | 第40页 |
| 2.2.4 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶的三维结构及模型分析 | 第40-41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-54页 |
| 3.1 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1的真核表达 | 第41-46页 |
| 3.1.1 steg1基因的克隆与序列分析 | 第41-43页 |
| 3.1.1.1 steg1基因的克隆 | 第41-42页 |
| 3.1.1.2 steg1基因序列的分析 | 第42-43页 |
| 3.1.2 原酶STEG1酵母工程菌的获得 | 第43-46页 |
| 3.1.2.1 酵母表达载体的构建 | 第43-44页 |
| 3.1.2.2 电击法转化P.pastorisGS115和酵母转化子的筛选与鉴定 | 第44-46页 |
| 3.1.3 原酶STEG1的诱导表达与纯化 | 第46页 |
| 3.1.4 原酶STEG1纯化产物的SDS-PAGE分析 | 第46页 |
| 3.2 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1突变体的真核表达 | 第46-49页 |
| 3.2.1 STEG1突变体的获得 | 第46-47页 |
| 3.2.2 STEG1突变体酵母工程菌的获得 | 第47-48页 |
| 3.2.2.1 STEG1突变体表达载体的构建 | 第47页 |
| 3.2.2.2 STEG1突变体酵母转化子的PCR验证 | 第47-48页 |
| 3.2.3 突变酶的诱导表达与纯化 | 第48页 |
| 3.2.4 突变酶的SDS-PAGE分析 | 第48-49页 |
| 3.3 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶性质的测定 | 第49-52页 |
| 3.3.1 酶的比活力测定结果 | 第49-50页 |
| 3.3.2 酶促反应最适温度的测定结果 | 第50页 |
| 3.3.3 酶促反应最适pH的测定结果 | 第50-51页 |
| 3.3.4 酶的热稳定性的测定结果 | 第51-52页 |
| 3.3.5 酶的动力学常数测定结果 | 第52页 |
| 3.4 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶三维结构模型对比分析 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54-58页 |
| 4.1 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1及突变酶的真核表达 | 第54-56页 |
| 4.1.1 原酶STEG1及其突变酶表达载体的构建 | 第54-55页 |
| 4.1.2 原酶和突变酶酵母工程菌的获得 | 第55页 |
| 4.1.3 原酶与突变酶的诱导表达与纯化 | 第55-56页 |
| 4.2 嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶的酶学活性测定 | 第56-58页 |
| 5 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第68页 |
