| 缩写表 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 目录 | 第10-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-38页 |
| 1 植物中硫氧还蛋白及其功能 | 第16-24页 |
| 1.1 概述 | 第16页 |
| 1.2 植物细胞中硫氧还蛋白的亚细胞定位 | 第16-19页 |
| 1.2.1 叶绿体Trx系统 | 第16-17页 |
| 1.2.2 线粒体Trx系统 | 第17-18页 |
| 1.2.3 细胞质Trx系统 | 第18-19页 |
| 1.3 植物中硫氧还蛋白的两个系统 | 第19-20页 |
| 1.3.1 NTR/TRX系统(依赖于NADPH的硫氧还蛋白系统) | 第19-20页 |
| 1.3.2 FTR/TRX系统(依赖于铁氧还蛋白的硫氧还蛋白系统) | 第20页 |
| 1.4 硫氧还蛋白作用方式 | 第20-21页 |
| 1.4.1 通过二硫键参与氧化还原调控 | 第20-21页 |
| 1.4.2 不依赖于氧化还原的功能 | 第21页 |
| 1.5 硫氧还蛋白的靶蛋白研究 | 第21-24页 |
| 1.5.1 利用蛋白巯基特异探针鉴定靶蛋白 | 第22-23页 |
| 1.5.2 利用点突变的硫氧还蛋白亲和纯化靶蛋白 | 第23-24页 |
| 2 植物中的活性氧与逆境胁迫 | 第24-38页 |
| 2.1 概述 | 第24-25页 |
| 2.2 植物中活性氧的产生 | 第25-26页 |
| 2.2.1 生物方式产生ROS | 第25页 |
| 2.2.2 非生物方式产生ROS | 第25-26页 |
| 2.3 植物中活性氧的清除 | 第26-28页 |
| 2.3.1 非酶促清除机制 | 第26页 |
| 2.3.2 酶促清除机制 | 第26-28页 |
| 2.4 植物中活性氧对细胞组分的修饰作用 | 第28-31页 |
| 2.4.1 活性氧对多不饱和脂肪酸(PUFAs)的修饰 | 第28-29页 |
| 2.4.2 活性氧对DNA的修饰 | 第29页 |
| 2.4.3 活性氧对糖类的修饰 | 第29页 |
| 2.4.4 活性氧对蛋白质的修饰 | 第29-31页 |
| 2.4.4.1 含硫氨基酸的氧化 | 第29-30页 |
| 2.4.4.2 羰基化 | 第30-31页 |
| 2.4.4.3 色氨酸的氧化 | 第31页 |
| 2.5 植物中活性氧参与信号通路的调节 | 第31-33页 |
| 2.5.1 活性氧是调控基因表达的信号分子 | 第31-32页 |
| 2.5.2 活性氧激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径 | 第32页 |
| 2.5.3 活性氧抑制蛋白磷酸酶的活性 | 第32页 |
| 2.5.4 活性氧激活转录因子 | 第32-33页 |
| 2.6 植物质外体活性氧的信号作用 | 第33-34页 |
| 2.6.1 抗病反应 | 第33页 |
| 2.6.2 气孔关闭 | 第33-34页 |
| 2.6.3 细胞扩张和发育 | 第34页 |
| 2.7 活性氧与逆境胁迫 | 第34-36页 |
| 2.8 展望 | 第36-38页 |
| 第二部分 研究论文 | 第38-96页 |
| 引言 | 第38-40页 |
| 1 材料与试剂 | 第40-41页 |
| 1.1 植物材料 | 第40页 |
| 1.2 菌株和载体 | 第40页 |
| 1.3 实验试剂及仪器 | 第40-41页 |
| 2 实验方法 | 第41-55页 |
| 2.1 水稻幼苗的培养 | 第41页 |
| 2.2 RNA的提取 | 第41页 |
| 2.3 RNA反转录及PCR扩增目的基因 | 第41页 |
| 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)及转化 | 第41-42页 |
| 2.5 细菌质粒DNA的小量提取及酶切连接 | 第42页 |
| 2.6 点突变硫氧还蛋白(OsTRXh1~(C43S))的构建 | 第42页 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第42页 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 2.9 蛋白质含量的测定 | 第43页 |
| 2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第43页 |
| 2.11 硫氧还蛋白还原胰岛素的活性检测 | 第43页 |
| 2.12 LiAc介导的质粒DNA转化酵母细胞 | 第43-44页 |
| 2.13 酵母突变体互补试验 | 第44页 |
| 2.14 基因枪法转化洋葱表皮进行瞬时表达 | 第44-45页 |
| 2.15 制备农杆菌感受态细胞 | 第45页 |
| 2.16 农杆菌的转化 | 第45页 |
| 2.17 农杆菌侵染烟草叶片进行瞬时表达 | 第45-46页 |
| 2.18 水稻幼苗的胁迫处理 | 第46页 |
| 2.19 水稻根质外体蛋白的提取 | 第46页 |
| 2.20 OsTRXh1的多克隆抗体制备 | 第46页 |
| 2.21 免疫印迹法(western blot) | 第46-47页 |
| 2.22 定量PCR | 第47-48页 |
| 2.23 水稻遗传转化 | 第48页 |
| 2.24 水稻GUS染色 | 第48-49页 |
| 2.25 Southern印迹杂交(Southern blot) | 第49-50页 |
| 2.26 石蜡切片 | 第50-51页 |
| 2.27 水稻叶片透明 | 第51-52页 |
| 2.28 盐胁迫处理 | 第52页 |
| 2.29 ABA处理 | 第52页 |
| 2.30 用试剂盒测水稻叶片的过氧化氢含量 | 第52-53页 |
| 2.31 用荧光染料检测水稻根质外体的活性氧变化 | 第53页 |
| 2.32 水稻幼苗全蛋白提取 | 第53页 |
| 2.33 纯化靶蛋白 | 第53-54页 |
| 2.34 胶体蓝染色 | 第54页 |
| 2.35 质谱鉴定 | 第54-55页 |
| 3 实验结果 | 第55-88页 |
| 3.1 水稻质外体硫氧还蛋白(OsTRXh1)氧化还原活性的鉴定 | 第55-62页 |
| 3.1.1 进化树分析 | 第55页 |
| 3.1.2 蛋白序列比对 | 第55-56页 |
| 3.1.3 OsTRXh1体外还原胰岛素的氧化还原活性 | 第56-60页 |
| 3.1.3.1 RT-PCR扩增目的片段 | 第56-57页 |
| 3.1.3.2 表达载体构建及细菌阳性克隆鉴定 | 第57页 |
| 3.1.3.3 重组蛋白的诱导表达 | 第57-58页 |
| 3.1.3.4 重组蛋白的纯化 | 第58-59页 |
| 3.1.3.5 体外还原胰岛素实验 | 第59-60页 |
| 3.1.4 酵母突变体互补实验 | 第60-62页 |
| 3.1.4.1 载体构建 | 第60-61页 |
| 3.1.4.2 酵母转化及阳性克隆的鉴定 | 第61页 |
| 3.1.4.3 酵母突变体的抗过氧化氢检测 | 第61-62页 |
| 3.2 水稻质外体硫氧还蛋白(OsTRXh1)的亚细胞定位和表达模式 | 第62-70页 |
| 3.2.1 OsTRXh1的亚细胞定位 | 第62-65页 |
| 3.2.1.1 OsTRXh1瞬时表达载体的构建 | 第62-63页 |
| 3.2.1.2 OsTRXh1在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位 | 第63-64页 |
| 3.2.1.3 OsTRXh1在烟草叶片表皮细胞中的亚细胞定位 | 第64-65页 |
| 3.2.2 逆境处理条件下OsTRXh1在水稻中的表达 | 第65-68页 |
| 3.2.2.1 盐处理条件下水稻根质外体中OsTRXh1蛋白的表达 | 第65-66页 |
| 3.2.2.2 盐处理条件下OsTRXh1基因在水稻中的表达 | 第66-67页 |
| 3.2.2.3 ABA处理条件下OsTRXh1基因在水稻中的表达 | 第67-68页 |
| 3.2.3 OsTRXh1在水稻中的组织表达模式 | 第68-70页 |
| 3.2.3.1 pCAMBIA1300-Pro_(OsTRXh1):GUS载体构建 | 第68-69页 |
| 3.2.3.2 pCAMBIA1300-Pro_(OsTRXh1):GUS的水稻遗传转化 | 第69页 |
| 3.2.3.3 OsTRXh1的组织表达模式 | 第69-70页 |
| 3.3 OsTRXh1调节质外体活性氧平衡进而影响水稻生长发育和逆境反应 | 第70-84页 |
| 3.3.1 RNAi及过表达载体构建 | 第70-72页 |
| 3.3.1.1 RNAi载体的构建 | 第70-72页 |
| 3.3.1.2 过表达载体的构建 | 第72页 |
| 3.3.2 RNAi及过表达植株的分子鉴定 | 第72-75页 |
| 3.3.2.1 RNAi及过表达植株的southern blot鉴定 | 第72-73页 |
| 3.3.2.2 RNAi及过表达植株的转录水平鉴定 | 第73-74页 |
| 3.3.2.3 RNAi及过表达植株的蛋白水平鉴定 | 第74-75页 |
| 3.3.3 RNAi植株的生长发育表型 | 第75-76页 |
| 3.3.4 盐胁迫下转基因植株的表型观察 | 第76-77页 |
| 3.3.5 转基因植株中盐反应基因的表达变化 | 第77-78页 |
| 3.3.6 ABA处理下转基因植株的表型观察 | 第78-81页 |
| 3.3.6.1 ABA处理下转基因植株的种子萌发情况 | 第78-79页 |
| 3.3.6.2 ABA处理下转基因植株的生长情况 | 第79-81页 |
| 3.3.7 转基因植株中ABA反应基因的表达变化 | 第81-82页 |
| 3.3.8 转基因植株活性氧的变化 | 第82-84页 |
| 3.3.8.1 转基因植株叶片过氧化氢含量检测 | 第82页 |
| 3.3.8.2 转基因植株的根质外体活性氧变化 | 第82-84页 |
| 3.4 OsTRXh1靶蛋白研究 | 第84-88页 |
| 3.4.1 纯化靶蛋白 | 第84-85页 |
| 3.4.2 利用SDS-PAGE检测靶蛋白的电泳条带 | 第85页 |
| 3.4.3 利用双向电泳对纯化的靶蛋白进行分析 | 第85-86页 |
| 3.4.4 靶蛋白的质谱鉴定与结果分析 | 第86-88页 |
| 4 讨论 | 第88-96页 |
| 4.1 OsTRXh1氧化还原活性 | 第88-89页 |
| 4.2 OsTRXh1的亚细胞定位和表达模式 | 第89-91页 |
| 4.3 OsTRXh1调节质外体活性氧平衡进而影响水稻生长发育和逆境反应 | 第91-93页 |
| 4.3.1 OsTRXh1在水稻生长发育中的功能 | 第91页 |
| 4.3.2 OsTRXh1在盐胁迫反应中的功能 | 第91-92页 |
| 4.3.3 OsTRXh1在ABA反应中的功能 | 第92-93页 |
| 4.4 水稻中OsTRXh1的靶蛋白 | 第93-96页 |
| 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-112页 |
| 个人简历 | 第112-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
