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人甲状旁腺激素类似物的设计与药效学评价

摘要第3-4页
Abstract第4页
第一章 绪论第8-16页
    1.1 骨质疏松症第8页
        1.1.1 定义及临床表现第8页
        1.1.2 临床治疗药物第8页
    1.2 人甲状旁腺激素第8-11页
        1.2.1 概述第8-9页
        1.2.2 生理作用第9-10页
        1.2.3 构效关系第10页
        1.2.4 信号通路第10-11页
    1.3 基因工程药物第11-12页
        1.3.1 原核表达系统和真核表达系统第11页
        1.3.2 基因工程药物在酵母表达系统中的表达第11-12页
        1.3.3 酵母表达体系存在的问题和解决方案第12页
    1.4 小分子蛋白药物的改造第12-14页
        1.4.1 小分子蛋白药物第12-13页
        1.4.2 小分子蛋白药物的改造策略第13页
        1.4.3 针对人甲状旁腺激素的改造方案第13页
        1.4.4 人血清白蛋白第13-14页
    1.5 立题背景及研究内容第14-16页
        1.5.1 立题背景第14页
        1.5.2 研究内容第14-16页
第二章 PTH(1-34)mt-HSA 的分子设计及构建第16-28页
    2.1 材料第16-17页
        2.1.1 质粒和菌种第16页
        2.1.2 培养基第16页
        2.1.3 工具酶第16-17页
        2.1.4 主要试剂第17页
        2.1.5 仪器与设备第17页
    2.2 方法第17-21页
        2.2.1 质粒PUC57-PTH(1-34)mt的设计与合成第17页
        2.2.2 质粒 PUC57-PTH(1-34)mt 的提取第17-18页
        2.2.3 引物设计与合成第18页
        2.2.4 PTH(1-34)mt 基因的 PCR 扩增第18页
        2.2.5 基因扩增产物片段的纯化第18-19页
        2.2.6 PTH (1-34)mt 基因片段和质粒 pBluescriptⅡ KS(+)-HSA 的双酶切第19页
        2.2.7 PTH (1-34)mt 基因片段和质粒 pBluescriptⅡ KS (+)-HSA 的连接第19页
        2.2.8 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备及重组质粒的转化第19-20页
        2.2.9 质粒 pB - PTH (1-34)mt- HSA 的双酶切鉴定第20页
        2.2.10 质粒 pB - PTH (1-34)mt- HSA 和 pPIC9K 的双酶切第20页
        2.2.11 pPIC9K - PTH (1-34 )mt- HSA 的构建第20-21页
    2.3 结果第21-25页
        2.3.1 PTH (1 - 34 )mt 基因的 PCR 扩增第21-22页
        2.3.2 质粒 pB - PTH (1-34 )mt- HSA 的构建及鉴定第22-23页
        2.3.4 重组质粒 pPIC9K - PTH (1 - 34 )mt- HSA 的构建及鉴定第23-25页
    2.4 讨论第25-26页
    2.5 小结第26-28页
第三章 PTH (1-34 ) mt- HSA 的表达与分离纯化第28-46页
    3.1 材料第28-30页
        3.1.1 菌株及质粒第28页
        3.1.2 培养基第28-29页
        3.1.3 相关试剂第29-30页
        3.1.4 仪器与设备第30页
    3.2 方法第30-35页
        3.2.1 线性化表达载体的制备第30-31页
        3.2.2 毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备第31页
        3.2.3 线性化质粒转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞第31页
        3.2.4 融合蛋白 PTH (1- 34)mt- HSA 的诱导表达和 SDS- PAGE 电泳分析第31-32页
        3.2.5 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 Westernblot 鉴定第32-33页
        3.2.6 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 5L 发酵罐发酵第33页
        3.2.7 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的分离纯化第33-34页
        3.2.8 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 纯化过程回收率计算第34页
        3.2.9 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的分子量检测和 N 端氨基酸分析第34-35页
    3.3 结果第35-44页
        3.3.1 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 高产菌株的筛选第35-36页
        3.3.2 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 Westernblot 鉴定第36-37页
        3.3.3 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的 5L 发酵罐发酵第37-39页
        3.3.4 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的分离纯化第39-41页
        3.3.5 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 纯化回收率第41页
        3.3.6 融合蛋白 PTH (1- 34)mt- HSA 的分子量测定和 N 端氨基酸分析第41-44页
    3.4 讨论第44-45页
    3.5 小结第45-46页
第四章 PTH (1-34)mt-HSA 的活性研究第46-56页
    4.1 材料第46-47页
        4.1.1 蛋白样品第46页
        4.1.2 细胞第46-47页
        4.1.3 主要试剂第47页
        4.1.4 荧光探针第47页
        4.1.5 仪器与设备第47页
    4.2 方法第47-49页
        4.2.1 UAMS - 32P 细胞的培养条件第47页
        4.2.2 UAMS - 32P 细胞的铺板培养与加药第47-48页
        4.2.3 UAMS - 32P 细胞总 RNA 的提取第48页
        4.2.4 总 RNA 的浓度及质量鉴定第48页
        4.2.5 RNA 反转录为 cDNA 第一链第48页
        4.2.6 实时荧光定量 PCR第48-49页
        4.2.7 破骨细胞形成实验 ( TRACP 染色法)第49页
        4.2.8 原代小鼠股骨骨髓贴壁细胞中 RANKL 、OPG 基因转录的变化第49页
    4.3 结果第49-53页
        4.3.1 融合蛋白对 UAMS-32P 细胞相关基因转录的影响第49-51页
        4.3.2 破骨细胞形成实验 (TRACP 染色法)第51-53页
        4.3.3 融合蛋白对原代小鼠股骨骨髓贴壁细胞中 RANKL、OPG 基因转录的影响第53页
    4.4 讨论第53-54页
    4.5 小结第54-56页
第五章 结论与展望第56-57页
    5.1 结论第56页
    5.2 展望第56-57页
致谢第57-58页
参考文献第58-62页
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文第62页

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