摘要 | 第3-4页 |
Abstract | 第4页 |
第一章 绪论 | 第8-16页 |
1.1 骨质疏松症 | 第8页 |
1.1.1 定义及临床表现 | 第8页 |
1.1.2 临床治疗药物 | 第8页 |
1.2 人甲状旁腺激素 | 第8-11页 |
1.2.1 概述 | 第8-9页 |
1.2.2 生理作用 | 第9-10页 |
1.2.3 构效关系 | 第10页 |
1.2.4 信号通路 | 第10-11页 |
1.3 基因工程药物 | 第11-12页 |
1.3.1 原核表达系统和真核表达系统 | 第11页 |
1.3.2 基因工程药物在酵母表达系统中的表达 | 第11-12页 |
1.3.3 酵母表达体系存在的问题和解决方案 | 第12页 |
1.4 小分子蛋白药物的改造 | 第12-14页 |
1.4.1 小分子蛋白药物 | 第12-13页 |
1.4.2 小分子蛋白药物的改造策略 | 第13页 |
1.4.3 针对人甲状旁腺激素的改造方案 | 第13页 |
1.4.4 人血清白蛋白 | 第13-14页 |
1.5 立题背景及研究内容 | 第14-16页 |
1.5.1 立题背景 | 第14页 |
1.5.2 研究内容 | 第14-16页 |
第二章 PTH(1-34)mt-HSA 的分子设计及构建 | 第16-28页 |
2.1 材料 | 第16-17页 |
2.1.1 质粒和菌种 | 第16页 |
2.1.2 培养基 | 第16页 |
2.1.3 工具酶 | 第16-17页 |
2.1.4 主要试剂 | 第17页 |
2.1.5 仪器与设备 | 第17页 |
2.2 方法 | 第17-21页 |
2.2.1 质粒PUC57-PTH(1-34)mt的设计与合成 | 第17页 |
2.2.2 质粒 PUC57-PTH(1-34)mt 的提取 | 第17-18页 |
2.2.3 引物设计与合成 | 第18页 |
2.2.4 PTH(1-34)mt 基因的 PCR 扩增 | 第18页 |
2.2.5 基因扩增产物片段的纯化 | 第18-19页 |
2.2.6 PTH (1-34)mt 基因片段和质粒 pBluescriptⅡ KS(+)-HSA 的双酶切 | 第19页 |
2.2.7 PTH (1-34)mt 基因片段和质粒 pBluescriptⅡ KS (+)-HSA 的连接 | 第19页 |
2.2.8 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备及重组质粒的转化 | 第19-20页 |
2.2.9 质粒 pB - PTH (1-34)mt- HSA 的双酶切鉴定 | 第20页 |
2.2.10 质粒 pB - PTH (1-34)mt- HSA 和 pPIC9K 的双酶切 | 第20页 |
2.2.11 pPIC9K - PTH (1-34 )mt- HSA 的构建 | 第20-21页 |
2.3 结果 | 第21-25页 |
2.3.1 PTH (1 - 34 )mt 基因的 PCR 扩增 | 第21-22页 |
2.3.2 质粒 pB - PTH (1-34 )mt- HSA 的构建及鉴定 | 第22-23页 |
2.3.4 重组质粒 pPIC9K - PTH (1 - 34 )mt- HSA 的构建及鉴定 | 第23-25页 |
2.4 讨论 | 第25-26页 |
2.5 小结 | 第26-28页 |
第三章 PTH (1-34 ) mt- HSA 的表达与分离纯化 | 第28-46页 |
3.1 材料 | 第28-30页 |
3.1.1 菌株及质粒 | 第28页 |
3.1.2 培养基 | 第28-29页 |
3.1.3 相关试剂 | 第29-30页 |
3.1.4 仪器与设备 | 第30页 |
3.2 方法 | 第30-35页 |
3.2.1 线性化表达载体的制备 | 第30-31页 |
3.2.2 毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备 | 第31页 |
3.2.3 线性化质粒转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞 | 第31页 |
3.2.4 融合蛋白 PTH (1- 34)mt- HSA 的诱导表达和 SDS- PAGE 电泳分析 | 第31-32页 |
3.2.5 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 Westernblot 鉴定 | 第32-33页 |
3.2.6 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 5L 发酵罐发酵 | 第33页 |
3.2.7 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的分离纯化 | 第33-34页 |
3.2.8 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 纯化过程回收率计算 | 第34页 |
3.2.9 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的分子量检测和 N 端氨基酸分析 | 第34-35页 |
3.3 结果 | 第35-44页 |
3.3.1 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 高产菌株的筛选 | 第35-36页 |
3.3.2 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 的 Westernblot 鉴定 | 第36-37页 |
3.3.3 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的 5L 发酵罐发酵 | 第37-39页 |
3.3.4 融合蛋白 PTH ( 1- 34 )mt- HSA 的分离纯化 | 第39-41页 |
3.3.5 融合蛋白 PTH (1-34 )mt- HSA 纯化回收率 | 第41页 |
3.3.6 融合蛋白 PTH (1- 34)mt- HSA 的分子量测定和 N 端氨基酸分析 | 第41-44页 |
3.4 讨论 | 第44-45页 |
3.5 小结 | 第45-46页 |
第四章 PTH (1-34)mt-HSA 的活性研究 | 第46-56页 |
4.1 材料 | 第46-47页 |
4.1.1 蛋白样品 | 第46页 |
4.1.2 细胞 | 第46-47页 |
4.1.3 主要试剂 | 第47页 |
4.1.4 荧光探针 | 第47页 |
4.1.5 仪器与设备 | 第47页 |
4.2 方法 | 第47-49页 |
4.2.1 UAMS - 32P 细胞的培养条件 | 第47页 |
4.2.2 UAMS - 32P 细胞的铺板培养与加药 | 第47-48页 |
4.2.3 UAMS - 32P 细胞总 RNA 的提取 | 第48页 |
4.2.4 总 RNA 的浓度及质量鉴定 | 第48页 |
4.2.5 RNA 反转录为 cDNA 第一链 | 第48页 |
4.2.6 实时荧光定量 PCR | 第48-49页 |
4.2.7 破骨细胞形成实验 ( TRACP 染色法) | 第49页 |
4.2.8 原代小鼠股骨骨髓贴壁细胞中 RANKL 、OPG 基因转录的变化 | 第49页 |
4.3 结果 | 第49-53页 |
4.3.1 融合蛋白对 UAMS-32P 细胞相关基因转录的影响 | 第49-51页 |
4.3.2 破骨细胞形成实验 (TRACP 染色法) | 第51-53页 |
4.3.3 融合蛋白对原代小鼠股骨骨髓贴壁细胞中 RANKL、OPG 基因转录的影响 | 第53页 |
4.4 讨论 | 第53-54页 |
4.5 小结 | 第54-56页 |
第五章 结论与展望 | 第56-57页 |
5.1 结论 | 第56页 |
5.2 展望 | 第56-57页 |
致谢 | 第57-58页 |
参考文献 | 第58-62页 |
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第62页 |