| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 第一章 锌指核酸酶介导的基因组靶向编辑 | 第15-36页 |
| 1.1 基因组靶向编辑 | 第15-16页 |
| 1.2 人工锌指核酸酶 | 第16-30页 |
| 1.2.1 人工锌指核酸酶的特点 | 第16-20页 |
| 1.2.2 特异锌指蛋白的获得 | 第20-24页 |
| 1.2.3 锌指核酸酶的锌指蛋白构建策略 | 第24-30页 |
| 1.3 锌指核酸酶介导的基因组靶向编辑 | 第30-33页 |
| 1.3.1 锌指核酸酶介导的基因组突变 | 第30-32页 |
| 1.3.2 锌指核酸酶介导的基因靶向敲入 | 第32-33页 |
| 1.4 锌指核酸酶在基因治疗中的应用 | 第33-34页 |
| 1.5 锌指核酸酶在经济物种中的应用 | 第34页 |
| 1.6 科学问题和研究意义 | 第34-36页 |
| 1.6.1 基因靶向敲入面临的挑战 | 第34-35页 |
| 1.6.2 锌指核酸酶的脱靶效应 | 第35-36页 |
| 第二章 ALPHAS1-CASEIN 基因研究进展 | 第36-38页 |
| 2.1 酪蛋白 | 第36-37页 |
| 2.2 Α S1 酪蛋白 | 第37页 |
| 2.3 奶山羊Α S1 酪蛋白 | 第37页 |
| 2.4 奶山羊Α S1-CASEIN 基因的靶向编辑 | 第37-38页 |
| 第三章 利用酵母系统筛选特异锌指核酸酶 | 第38-63页 |
| 3.1 实验材料 | 第38-40页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第38-39页 |
| 3.1.2 试剂 | 第39页 |
| 3.1.3 培养基配制 | 第39页 |
| 3.1.4 引物和序列 | 第39-40页 |
| 3.2 实验方法 | 第40-50页 |
| 3.2.1 酵母菌株 AH109 基因型鉴定 | 第40页 |
| 3.2.2 靶位点的选择 | 第40页 |
| 3.2.3 报告载体和报告菌株的构建 | 第40-43页 |
| 3.2.4 随机锌指核酸酶文库的构建 | 第43-45页 |
| 3.2.5 活性锌指核酸酶的筛选 | 第45-49页 |
| 3.2.6 从酵母细胞中恢复 ZFN 表达质粒 | 第49-50页 |
| 3.3 实验结果 | 第50-60页 |
| 3.3.1 酵母菌株 AH109 基因型鉴定 | 第50页 |
| 3.3.2 奶山羊α s1-casein 基因靶位点的选择 | 第50-51页 |
| 3.3.3 报告载体和报告菌株的获得 | 第51-54页 |
| 3.3.4 三个随机锌指核酸酶文库的构建 | 第54-57页 |
| 3.3.5 锌指核酸酶的筛选 | 第57-60页 |
| 3.4 讨论 | 第60-62页 |
| 3.5 小结 | 第62-63页 |
| 第四章 锌指核酸酶的活性鉴定 | 第63-83页 |
| 4.1 实验材料 | 第64-65页 |
| 4.1.1 细胞系和质粒 | 第64页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第64-65页 |
| 4.1.3 试剂和培养基配制 | 第65页 |
| 4.1.4 引物和序列 | 第65页 |
| 4.2 实验方法 | 第65-69页 |
| 4.2.1 细胞培养和传代 | 第65页 |
| 4.2.2 细胞转染 | 第65-66页 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测荧光细胞 | 第66页 |
| 4.2.4 锌指核酸酶表达载体的构建 | 第66页 |
| 4.2.5 pDsRed-EGFP-BS 报告系统 | 第66-68页 |
| 4.2.6 pEGFP-DsRed-BS 报告系统 | 第68页 |
| 4.2.7 pmRFP-EGFP-BS 报告系统 | 第68-69页 |
| 4.3 结果 | 第69-80页 |
| 4.3.1 锌指核酸酶真核表达载体的获得 | 第69-70页 |
| 4.3.2 pDsRed-EGFP-BS 报告系统检测锌指核酸酶活性 | 第70-73页 |
| 4.3.3 pEGFP-DsRed-BS 报告系统检测锌指核酸酶活性 | 第73-75页 |
| 4.3.4 pmRFP-EGFP-BS 报告系统检测锌指核酸酶活性 | 第75-80页 |
| 4.4 讨论 | 第80-81页 |
| 4.5 小结 | 第81-83页 |
| 第五章 锌指核酸酶靶向编辑奶山羊基因组 | 第83-105页 |
| 5.1 实验材料 | 第84-85页 |
| 5.1.1 菌株，细胞系和质粒 | 第84页 |
| 5.1.2 实验试剂和主要仪器 | 第84页 |
| 5.1.3 试剂和培养基配制 | 第84页 |
| 5.1.4 引物和序列 | 第84-85页 |
| 5.2 实验方法 | 第85-90页 |
| 5.2.1 奶山羊乳腺上皮细胞培养和传代 | 第85页 |
| 5.2.2 奶山羊乳腺上皮细胞 So-Fast 试剂转染 | 第85页 |
| 5.2.3 奶山羊乳腺上皮细胞电转染 | 第85-86页 |
| 5.2.4 奶山羊乳腺上皮细胞电转染条件优化 | 第86-87页 |
| 5.2.5 奶山羊乳腺上皮细胞基因组提取 | 第87-88页 |
| 5.2.6 PCR 扩增基因组中的靶序列 | 第88页 |
| 5.2.7 核酸内切酶 T7 E1 检测基因组突变 | 第88-89页 |
| 5.2.8 嘌呤霉素抗性基因报告载体的构建 | 第89-90页 |
| 5.2.9 锌指核酸酶作用于靶基因 | 第90页 |
| 5.3 实验结果 | 第90-103页 |
| 5.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞的转染 | 第90-92页 |
| 5.3.2 电转染优化 | 第92-95页 |
| 5.3.3 嘌呤霉素抗性基因报告载体的构建 | 第95-97页 |
| 5.3.4 阳性细胞的筛选和富集 | 第97-100页 |
| 5.3.5 PCR 扩增靶序列 | 第100页 |
| 5.3.6 靶基因突变检测 | 第100-103页 |
| 5.4 讨论 | 第103-104页 |
| 5.5 小结 | 第104-105页 |
| 第六章 锌指核酸酶介导的酵母双杂交系统 | 第105-117页 |
| 6.1 实验材料 | 第105-106页 |
| 6.1.1 菌株和质粒 | 第105页 |
| 6.1.2 实验试剂 | 第105-106页 |
| 6.2 实验方法 | 第106-108页 |
| 6.2.1 质粒构建 | 第106-107页 |
| 6.2.2 酵母转化和有限稀释培养 | 第107页 |
| 6.2.3 β-半乳糖苷酶活性检测 | 第107页 |
| 6.2.4 cDNA 文库构建 | 第107-108页 |
| 6.2.5 cDNA 文库筛选 | 第108页 |
| 6.3 实验结果 | 第108-115页 |
| 6.3.1 双杂交系统设计 | 第108-110页 |
| 6.3.2 不同长度连接子对 ZFN 活性的影响 | 第110-111页 |
| 6.3.3 利用蛋白相互作用募集活性 ZFN | 第111-114页 |
| 6.3.4 cDNA 文库筛选 | 第114-115页 |
| 6.4 讨论 | 第115-116页 |
| 6.5 小结 | 第116-117页 |
| 结论与创新点 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-129页 |
| 缩略词 | 第129-131页 |
| 致谢 | 第131-133页 |
| 作者简介 | 第133-134页 |
