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阴道毛滴虫RRas基因克隆,表达及鉴定

摘要第4-6页
ABSTRACT第6-8页
英文缩略词表第9-14页
1 前言第14-17页
    1.1 阴道毛滴虫及阴道毛滴虫病第14页
    1.2 阴道毛滴虫致病机制第14-15页
    1.3 研究意义第15-17页
2 实验材料第17-21页
    2.1 使用仪器第17-18页
    2.2 主要试剂第18-19页
    2.3 质粒和宿主菌第19-20页
    2.4 阴道毛滴虫虫株,细胞系及实验动物第20-21页
3 实验方法及步骤第21-43页
    3.1 阴道毛滴虫RRas基因的生物学分析第21页
    3.2 引物设计第21页
    3.3 阴道毛滴虫培养第21-23页
        3.3.1 TYM培养基第21-22页
        3.3.2 青霉素钠,硫酸链霉素储存液第22页
        3.3.3 培养方法第22-23页
        3.3.4 阴道毛滴虫保存,复苏第23页
    3.4 阴道毛滴虫总RNA的提取第23-24页
        3.4.1 实验准备第23页
        3.4.2 阴道毛滴虫Total RNA的提取步骤:第23-24页
        3.4.3 注意事项第24页
    3.5 逆转录获得总c DNA第24-25页
    3.6 PCR扩增目的基因片段第25-26页
        3.6.1 PCR引物设计第25页
        3.6.2 插入片段PCR扩增第25-26页
    3.7 PCR产物检测第26页
        3.7.1 1.5%琼脂糖凝胶的制备第26页
        3.7.2 检测方法第26页
    3.8 PCR产物纯化第26-27页
        3.8.1 PCR产物纯化试剂盒实验准备第26页
        3.8.2 操作步骤第26-27页
    3.9 质粒提取第27-28页
        3.9.1 相关试剂的配置方法第27页
        3.9.2 质粒小量制备试剂盒实验准备第27页
        3.9.3 快速操作步骤第27-28页
    3.10 质粒胶回收第28-29页
        3.10.1 使用实验准备第28页
        3.10.2 快速操作步骤第28-29页
    3.11 质粒线性化第29页
    3.12 目的基因与质粒的重组反应第29-30页
    3.13 BL21感受态制备第30-31页
    3.14 反应产物转化、涂板第31页
    3.15 质粒阴阳性克隆鉴定第31-32页
    3.16 重组表达质粒PQE-80L/ Tv RRas双酶切鉴定第32页
    3.17 诱导表达第32页
    3.18 1.0mm SDS-PAGE凝胶制作第32-33页
        3.18.1 试剂组成第32-33页
        3.18.2 操作步骤第33页
    3.19 重组蛋白的可溶性鉴定第33-34页
        3.19.1 一步法细菌活性蛋白提取第33页
        3.19.2 操作步骤第33-34页
        3.19.3 鉴定步骤第34页
    3.20 可溶性蛋白纯化、复性及保存第34-36页
        3.20.1 Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒组成第35页
        3.20.2 操作步骤第35页
        3.20.3 透析及保存第35-36页
    3.21 Western-blot鉴定第36-37页
        3.21.1 试剂配制第36页
        3.21.2 Western-blot操作步骤第36-37页
    3.22 动物实验第37-40页
        3.22.1 ELISA相关试剂配制第37-38页
        3.22.2 免疫小鼠制备抗血清第38-40页
    3.23 阴道毛滴虫重组蛋白western-blot分析第40页
    3.24 细胞实验第40-42页
        3.24.1 细胞培养准备第40页
        3.24.2 实验前准备第40-41页
        3.24.3 洗手和着装第41页
        3.24.4 细胞复苏第41页
        3.24.5 CCK8实验第41-42页
    3.25 数据处理第42-43页
4 结果第43-62页
    4.1 Tv RRas的生物学分析第43-48页
    4.2 引物设计第48-49页
    4.3 阴道毛滴虫RRas基因PCR扩增第49-50页
    4.4 PQE-80L载体质粒线性化结果第50-51页
    4.5 质粒阴阳性克隆鉴定第51-52页
    4.6 重组表达质粒PQE-80L/ Tv RRas双酶切鉴定第52-53页
    4.7 测序结果第53-54页
    4.8 重组蛋白的可溶性分析第54-55页
    4.9 重组蛋白的纯化第55-56页
    4.10 阴道毛滴虫RRas重组蛋白的Western-blot第56-59页
    4.11 细胞实验第59-62页
        4.11.1 蛋白浓度测定标准曲线第59页
        4.11.2 CCK8实验结果第59-62页
5. 讨论第62-66页
    5.1 阴道毛滴虫RRas一步克隆表达的分析第62-63页
    5.2 阴道毛滴虫western-blot分析第63-64页
    5.3 细胞实验分析第64-66页
6 结论第66-67页
参考文献第67-76页
综述第76-92页
    参考文献第83-92页
个人简历第92-93页
致谢第93页

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