纳豆激酶在毕赤酵母中的表达及在大鼠体内溶栓作用的研究
| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 主要符号表 | 第13-14页 |
| 第1章 绪论 | 第14-26页 |
| 1.1 溶栓药物的研究开发 | 第14-17页 |
| 1.1.1 血栓性疾病 | 第14页 |
| 1.1.2 血栓形成的机制 | 第14-16页 |
| 1.1.3 溶栓药物开发 | 第16-17页 |
| 1.2 纳豆激酶及其性质 | 第17-20页 |
| 1.2.1 纳豆激酶 | 第17页 |
| 1.2.2 纳豆激酶的性质 | 第17-18页 |
| 1.2.3 纳豆激酶的研究进展 | 第18-20页 |
| 1.3 提高产量的生物学基础 | 第20-24页 |
| 1.3.1 在分子生物学基础上对基因改造 | 第20-21页 |
| 1.3.2 表达系统的选择 | 第21页 |
| 1.3.3 毕赤酵母表达系统 | 第21-22页 |
| 1.3.4 表达载体选择及整合 | 第22页 |
| 1.3.5 毕赤酵母转化和筛选 | 第22-23页 |
| 1.3.6 培养条件的优化 | 第23-24页 |
| 1.4 纳豆激酶的溶栓作用及安全性的研究 | 第24-25页 |
| 1.4.1 溶栓作用 | 第24页 |
| 1.4.2 安全性研究 | 第24-25页 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 | 第25-26页 |
| 1.5.1 研究目的 | 第25页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第25-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-30页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第26页 |
| 2.1.2 药品试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.3 培养基配方 | 第27-28页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 2.1.5 实验中主要缓冲液配方 | 第29-30页 |
| 2.1.6 实验动物 | 第30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-44页 |
| 2.2.1 引物设计与合成 | 第30-32页 |
| 2.2.2 目的基因的合成 | 第32-33页 |
| 2.2.3 目的片段及载体的纯化 | 第33页 |
| 2.2.4 用T4 DNA聚合酶处理目的片段 | 第33-34页 |
| 2.2.5 质粒的提取方法 | 第34页 |
| 2.2.6 表达载体的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态的制备及其转化方法 | 第35-36页 |
| 2.2.8 毕赤酵母感受态的制备及其转化方法 | 第36-37页 |
| 2.2.9 外源基因在毕赤酵母中的摇瓶诱导表达 | 第37页 |
| 2.2.10 重组纳豆激酶在发酵罐中的表达 | 第37-38页 |
| 2.2.11 蛋白质的纯化 | 第38页 |
| 2.2.12 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白 | 第38-39页 |
| 2.2.13 Bradford法测定蛋白浓度 | 第39页 |
| 2.2.14 蛋白酶活的测定 | 第39-40页 |
| 2.2.15 纳豆激酶酶学性质分析 | 第40-41页 |
| 2.2.16 体内溶栓研究 | 第41-42页 |
| 2.2.17 血栓模型 | 第42页 |
| 2.2.18 灌胃方法 | 第42页 |
| 2.2.19 取血方法 | 第42页 |
| 2.2.20 生理数据测定 | 第42-43页 |
| 2.2.21 大鼠耳部组织切片的制作及HE染色 | 第43-44页 |
| 第3章 结果与分析 | 第44-59页 |
| 3.1 表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.1.1 纳豆激酶基因来源及优化 | 第44-45页 |
| 3.1.2 纳豆激酶引物设计及基因合成 | 第45页 |
| 3.1.3 载体的构建 | 第45页 |
| 3.2 纳豆激酶在毕赤酵母中的表达 | 第45-49页 |
| 3.2.1 纳豆激酶重组菌株的筛选 | 第45-46页 |
| 3.2.2 纳豆激酶在摇瓶中的表达 | 第46-47页 |
| 3.2.3 纳豆激酶在发酵罐中的表达 | 第47-48页 |
| 3.2.4 重组纳豆激酶的纯化 | 第48-49页 |
| 3.3 纳豆激酶酶学性质分析 | 第49-54页 |
| 3.3.1 最适pH | 第49-50页 |
| 3.3.2 最适温度 | 第50页 |
| 3.3.3 pH稳定性分析 | 第50-51页 |
| 3.3.4 热稳定性分析 | 第51-52页 |
| 3.3.5 添加剂对酶活的影响 | 第52-54页 |
| 3.3.6 纳豆激酶的糖基化检测 | 第54页 |
| 3.4 纳豆激酶的溶栓作用 | 第54-59页 |
| 3.4.1 纳豆激酶的体外溶栓作用 | 第54-55页 |
| 3.4.2 大鼠血栓模型的构建 | 第55-57页 |
| 3.4.3 纳豆激酶的体内溶栓 | 第57-58页 |
| 3.4.4 耳部组织切片 | 第58-59页 |
| 第4章 讨论与展望 | 第59-62页 |
| 4.1 讨论 | 第59-60页 |
| 4.2 展望 | 第60-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-66页 |
| 附录 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
