| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| ·富马酸的概况 | 第14-16页 |
| ·富马酸的理化性质 | 第14页 |
| ·富马酸的用途 | 第14-15页 |
| ·富马酸的生产方法 | 第15-16页 |
| ·草酰乙酸及苹果酸的概况 | 第16-17页 |
| ·草酰乙酸的概况 | 第16-17页 |
| ·苹果酸的概况 | 第17页 |
| ·富马酸的代谢分析 | 第17-21页 |
| ·富马酸的代谢网络 | 第17-18页 |
| ·富马酸的代谢分析 | 第18-19页 |
| ·富马酸代谢路径中的关键酶 | 第19-20页 |
| ·丙酮酸羧化酶(PC) | 第19页 |
| ·富马酸酶(FUM) | 第19-20页 |
| ·乳酸脱氢酶(LDH) | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母的生物学特性 | 第21页 |
| ·毕赤酵母的载体 | 第21页 |
| ·毕赤酵母宿主菌 | 第21-22页 |
| ·富马酸基因工程菌的研究 | 第22-23页 |
| ·富马酸基因工程菌构建的相关研究进展 | 第22页 |
| ·丙酮酸羧化酶的研究进展 | 第22-23页 |
| ·研究计划部分 | 第23-26页 |
| ·课题的创新之处 | 第23页 |
| ·课题的构建思路 | 第23-24页 |
| ·论文选题的立论、目的和意义 | 第24页 |
| ·课题的主要研究内容 | 第24-26页 |
| 第二章 米根霉富马酸酶基因的克隆 | 第26-42页 |
| ·引言 | 第26页 |
| ·材料与方法 | 第26-35页 |
| ·菌株与质粒 | 第26页 |
| ·实验试剂及实验设备 | 第26-27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27-35页 |
| ·RNA提取前的准备工作 | 第27页 |
| ·试剂盒Trizol法提取总RNA | 第27页 |
| ·改进的Trizol法提取总RNA | 第27-28页 |
| ·热苯酚法提取总RNA | 第28页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测总RNA | 第28-29页 |
| ·总RNA纯度和完整性及产量的测定 | 第29页 |
| ·两步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因fumR | 第29-30页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳回收fumR DNA片段 | 第30-31页 |
| ·目的基因fumR与T载体的连接 | 第31页 |
| ·大肠杆菌DH5α化学转化法感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·fumR-pMD18-T重组载体的化学转化 | 第32页 |
| ·fumR-pMD18-T重组子阳性克隆的筛选 | 第32-33页 |
| ·PCR产物的序列分析 | 第33页 |
| ·巢式PCR扩增fumR基因片段 | 第33-34页 |
| ·RT-PCR扩增fumR片段中的保守区域 | 第34-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-40页 |
| ·米根霉(Rhizopus oryzae CGMCC 3.2686)总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·总RNA纯度和产量的测定 | 第36页 |
| ·RT-PCR扩增fumR | 第36页 |
| ·T载体重组子的鉴定 | 第36-38页 |
| ·米根霉基因组的提取 | 第38页 |
| ·以米根霉基因组为模板扩增fumR序列 | 第38-39页 |
| ·fumR保守区域的扩增 | 第39-40页 |
| ·小结 | 第40-42页 |
| 第三章 丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母中的过量表达 | 第42-70页 |
| ·引言 | 第42页 |
| ·材料与方法 | 第42-51页 |
| ·菌株与质粒 | 第42页 |
| ·实验试剂和仪器设备 | 第42页 |
| ·培养基与培养条件 | 第42-43页 |
| ·实验方法 | 第43-51页 |
| ·毕赤酵母GS115基因组的提取 | 第43-44页 |
| ·聚合酶链式反应(PCR)扩增丙酮酸羧化酶基因PC | 第44-45页 |
| ·PC基因与pMD18-T载体的连接 | 第45页 |
| ·重组DNA的电转化 | 第45-46页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第46-47页 |
| ·PC基因的测序分析 | 第47页 |
| ·重组表达质粒pPIC3.5K-PC的构建 | 第47-48页 |
| ·重组质粒pPIC3.5K-PC的鉴定 | 第48页 |
| ·毕赤酵母感受态度制备(电转化) | 第48-49页 |
| ·His~+Mut~+重组子的筛选 | 第49页 |
| ·毕赤酵母重组子的PCR鉴定 | 第49页 |
| ·毕赤酵母中甲醇诱导表达丙酮酸羧化酶 | 第49-50页 |
| ·SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白浓度的测定 | 第50页 |
| ·丙酮酸羧化酶酶活的测定 | 第50-51页 |
| ·重组菌的生长情况 | 第51页 |
| ·结果与讨论 | 第51-67页 |
| ·毕赤酵母基因组提取 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增丙酮酸羧化酶基因PC | 第52-54页 |
| ·PC克隆的阳性重组子的菌落PCR验证 | 第52-53页 |
| ·T载体重组质粒的酶切验证 | 第53-54页 |
| ·PC基因的序列分析 | 第54页 |
| ·重组表达质粒pPIC3.5K-PC的构建 | 第54-57页 |
| ·pPIC3.5K-PC重组子的菌落PCR鉴定 | 第54页 |
| ·pPIC3.5K-PC的酶切鉴定 | 第54-56页 |
| ·pPIC3.5K-PC测序分析 | 第56-57页 |
| ·pPIC3.5K-PC毕赤酵母重组子His~+Mut~+表型的筛选 | 第57-58页 |
| ·His~+表型重组子的筛选 | 第57页 |
| ·His~+Mut~+表型毕赤酵母重组子的筛选 | 第57-58页 |
| ·His~+Mut~+表型重组子的PCR分析鉴定 | 第58-59页 |
| ·重组丙酮酸羧化酶的诱导表达 | 第59-61页 |
| ·蛋白浓度标准曲线的绘制 | 第59-60页 |
| ·目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间的确定 | 第60页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第60-61页 |
| ·重组丙酮酸羧化酶的酶活测定 | 第61-62页 |
| ·重组菌的生长曲线 | 第62页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第62-66页 |
| ·富马酸标准曲线的绘制 | 第62-63页 |
| ·草酰乙酸的标准曲线的绘制 | 第63-64页 |
| ·L-苹果酸标准曲线的绘制 | 第64-65页 |
| ·乙醇标准曲线的绘制 | 第65-66页 |
| ·富马酸、苹果酸、草酰乙酸发酵生产 | 第66-67页 |
| ·小结 | 第67-70页 |
| 第四章 乳酸脱氢酶基因LDH敲除载体的构建 | 第70-78页 |
| ·引言 | 第70页 |
| ·材料与方法 | 第70-72页 |
| ·菌株与质粒 | 第70页 |
| ·实验试剂和仪器设备 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70-71页 |
| ·实验方法 | 第71-72页 |
| ·毕赤酵母GS115基因组的提取 | 第71页 |
| ·毕赤酵母GS115乳酸脱氢酶基因LDH的克隆 | 第71-72页 |
| ·PCR扩增博来霉素基因(Zeocin) | 第72页 |
| ·敲除载体pMD18-T-LDHup-Zeocin-LDHdown载体的构建 | 第72页 |
| ·实验结果与讨论 | 第72-76页 |
| ·LDH乳酸脱氢酶基因的克隆 | 第72-74页 |
| ·PCR扩增zeocin编码基因 | 第74页 |
| ·zeocin编码基因的克隆 | 第74-75页 |
| ·菌落PCR的分析 | 第74-75页 |
| ·酶切鉴定重组质粒pMD18-T-zeocin | 第75页 |
| ·敲除质粒pMD18-T-LDH-up-zeocin-down-LDH的构建 | 第75-76页 |
| ·小结 | 第76-78页 |
| 第五章 实验总结与建议 | 第78-80页 |
| ·主要结论 | 第78页 |
| ·建议 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-84页 |
| 附录 | 第84-88页 |
| 致谢 | 第88-90页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第90-92页 |
| 作者和导师简介 | 第92-93页 |
| 附件 | 第93-94页 |
