| 目录 | 第5-9页 |
| 摘要 | 第9-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 英文缩写表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-27页 |
| 引言 | 第13页 |
| 1. 副溶血弧菌的分子生物学 | 第13-15页 |
| 1.1 基因组DNA | 第13页 |
| 1.2 质粒DNA | 第13-14页 |
| 1.3 鞭毛基因系统 | 第14页 |
| 1.4 毒力因子 | 第14-15页 |
| 1.4.1 耐热溶血毒素 | 第14-15页 |
| 1.4.2 不耐热溶血毒素 | 第15页 |
| 1.4.3 耐热溶血毒素相关溶血毒素因子 | 第15页 |
| 1.4.4 尿素酶 | 第15页 |
| 2. 副溶血弧菌的检测 | 第15-18页 |
| 2.1 常规的细菌学检测 | 第16页 |
| 2.2 血清学-免疫学检测 | 第16页 |
| 2.3 基因检测 | 第16-18页 |
| 2.3.1 基因探针检测 | 第17页 |
| 2.3.2 PCR检测 | 第17页 |
| 2.3.3 其他方法 | 第17-18页 |
| 2.4 生物芯片检测 | 第18页 |
| 3. 生物芯片研究进展 | 第18-23页 |
| 3.1 生物芯片的分类 | 第19-20页 |
| 3.1.1 基因芯片 | 第19页 |
| 3.1.2 蛋白质芯片 | 第19页 |
| 3.1.3 芯片反应室 | 第19-20页 |
| 3.2 生物芯片的制备 | 第20-21页 |
| 3.2.1 芯片基质的选择 | 第20页 |
| 3.2.2 微列阵的制作 | 第20-21页 |
| 3.2.3 芯片生化反应 | 第21页 |
| 3.2.4 生物芯片的检测与结果分析 | 第21页 |
| 3.3 生物芯片的应用 | 第21-23页 |
| 3.3.1 生物芯片与疾病诊断 | 第21页 |
| 3.3.2 生物芯片与基因突变检测 | 第21-22页 |
| 3.3.3 生物芯片与基因表达分析 | 第22页 |
| 3.3.4 生物芯片与药物开发 | 第22-23页 |
| 3.3.5 生物芯片与环境科学 | 第23页 |
| 4. 基因工程单链抗体技术 | 第23-27页 |
| 4.1 单链抗体基因的获取与构建 | 第23-24页 |
| 4.2 单链抗体的表达 | 第24页 |
| 4.3 噬菌体抗体库的构建 | 第24-25页 |
| 4.3.1 噬菌体基本特征 | 第24-25页 |
| 4.3.2 噬菌体展示技术的基本原理 | 第25页 |
| 4.4 单链抗体融合蛋白研究 | 第25-26页 |
| 4.4.1 scFv融合蛋白与scFv稳定性 | 第25页 |
| 4.4.2 双功能融合蛋白 | 第25-26页 |
| 4.5 单链抗体的应用 | 第26-27页 |
| 4.5.1 靶向载体 | 第26页 |
| 4.5.2 诊断 | 第26页 |
| 4.5.3 治疗 | 第26-27页 |
| 第二章 副溶血弧菌的基因芯片检测 | 第27-39页 |
| 引言 | 第27页 |
| 1 材料 | 第27-28页 |
| 1.1 菌株 | 第27页 |
| 1.2 试剂 | 第27页 |
| 1.3 PCR引物 | 第27-28页 |
| 2 实验方法 | 第28-32页 |
| 2.1 细菌基因组的提取 | 第28页 |
| 2.2 液相PCR | 第28-29页 |
| 2.3 芯片反应室的制备 | 第29-30页 |
| 2.4 Bio-dUTP三重PCR | 第30页 |
| 2.5 基因芯片杂交 | 第30页 |
| 2.6 芯片酶学检测 | 第30-31页 |
| 2.7 实际样品的检测 | 第31-32页 |
| 结果与分析 | 第32-37页 |
| 1 基因芯片杂交的原理 | 第32页 |
| 2 液相PCR | 第32-35页 |
| 3 实际样品的检测 | 第35-37页 |
| 讨论 | 第37-38页 |
| 1 多重PCR | 第37页 |
| 2 DNA-DNA杂交 | 第37页 |
| 3 灵敏度 | 第37-38页 |
| 4 实际样品的检测 | 第38页 |
| 结论 | 第38-39页 |
| 第三章 副溶血弧菌不耐热溶血素(TLH)的高效表达与鉴定 | 第39-50页 |
| 引言 | 第39页 |
| 材料与方法 | 第39-44页 |
| 1 材料 | 第39-40页 |
| 1.1 菌株与质粒 | 第39-40页 |
| 1.2 培养基 | 第40页 |
| 1.3 试剂与材料 | 第40页 |
| 2 实验方法 | 第40-44页 |
| 2.1 大肠杆菌质粒的提取 | 第40页 |
| 2.2 PCR扩增tlh基因 | 第40-41页 |
| 2.3 表达载体pET32a-tlh | 第41页 |
| 2.4 大肠杆菌的转化 | 第41-42页 |
| 2.4.1 感受态细胞的制备 | 第41-42页 |
| 2.4.2 大肠杆菌的转化 | 第42页 |
| 2.5 重组质粒的筛选、检测 | 第42页 |
| 2.6 蛋白质的诱导生成 | 第42页 |
| 2.7 蛋白质的纯化 | 第42-43页 |
| 2.8 SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量 | 第43页 |
| 2.9 蛋白质的浓度测定 | 第43-44页 |
| 结果与分析 | 第44-49页 |
| 1 表达载体pET32a-tlh的构建 | 第44-48页 |
| 2 融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化 | 第48-49页 |
| 讨论 | 第49页 |
| 1 副溶血弧菌TLH的原核表达载体pET32a(+)-tlh的构建 | 第49页 |
| 2 融合蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化 | 第49页 |
| 结论 | 第49-50页 |
| 第四章 单链抗体的淘选 | 第50-66页 |
| 引言 | 第50页 |
| 材料与方法 | 第50-58页 |
| 1 材料 | 第50-52页 |
| 1.1 细胞及细胞株 | 第50页 |
| 1.2 质粒载体 | 第50-51页 |
| 1.3 PCR产物 | 第51页 |
| 1.4 试剂与材料 | 第51页 |
| 1.5 培养基 | 第51-52页 |
| 2 实验方法 | 第52-58页 |
| 2.1 动物免疫 | 第52页 |
| 2.2 测血清效价 | 第52页 |
| 2.3 总RNA的提取 | 第52-53页 |
| 2.4 第一链cDNA反转录合成 | 第53页 |
| 2.5 轻、重链基因的扩增 | 第53-54页 |
| 2.6 scFv DNA的组装与扩增 | 第54页 |
| 2.7 scFv DNA片段的sfi Ⅰ/Not Ⅰ酶切 | 第54-55页 |
| 2.8 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建 | 第55页 |
| 2.9 重组噬菌体的制备 | 第55页 |
| 2.10 库容量的滴定 | 第55页 |
| 2.11 单链抗体噬菌体抗体库的富集淘选 | 第55-56页 |
| 2.12 用ELISA方法检测TLH蛋白质特异性的单链抗体 | 第56页 |
| 2.13 scFv序列分析 | 第56-57页 |
| 2.14 scFv可溶性表达与ELISA检测 | 第57页 |
| 2.15 scFv亲和力的测定 | 第57-58页 |
| 结果与分析 | 第58-65页 |
| 1. 效价的测定 | 第58-59页 |
| 2. V_H和V_L的扩增 | 第59页 |
| 3. scFv DNA的组装与扩增 | 第59-60页 |
| 4. 噬菌体抗体库载体的构建 | 第60页 |
| 5. 噬菌体抗体库的构建 | 第60页 |
| 6. scFv的噬菌体表面展示与淘选 | 第60-62页 |
| 7. scFv的特异性鉴定 | 第62页 |
| 8. scFv的酶切和PCR验证 | 第62页 |
| 9. scFv测序 | 第62页 |
| 10. scFv的可溶性表达与ELISA检测 | 第62-65页 |
| 讨论 | 第65页 |
| 1. 小鼠免疫与效价测定 | 第65页 |
| 2. RNA提取 | 第65页 |
| 3. scFv的组装与扩增 | 第65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-79页 |
