| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 插图和附表清单 | 第11-13页 |
| 缩略语表 | 第13-14页 |
| 1 引言 | 第14-29页 |
| ·流感病毒概述 | 第14页 |
| ·历史上重大的流感爆发事件 | 第14-16页 |
| ·流感病毒的结构 | 第16页 |
| ·流感病毒的转录和复制 | 第16-17页 |
| ·流感病毒的装配 | 第17页 |
| ·流感病毒的基因组及其编码蛋白质 | 第17-20页 |
| ·HA 基因 | 第17-18页 |
| ·NA 基因 | 第18页 |
| ·NP 基因 | 第18-19页 |
| ·M 基因 | 第19页 |
| ·编码聚合酶蛋白的基因 | 第19-20页 |
| ·NS 基因 | 第20页 |
| ·抗流感病毒药物 | 第20-22页 |
| ·抑制 M 2 离子通道蛋白药物 | 第20-21页 |
| ·抑制 NA 神经氨酸酶的药物 | 第21页 |
| ·其它 | 第21-22页 |
| ·抗流感病毒的中药 | 第22页 |
| ·流感病毒疫苗 | 第22-25页 |
| ·灭活疫苗 | 第22-23页 |
| ·活病毒疫苗 | 第23页 |
| ·亚单位疫苗 | 第23页 |
| ·重组活载体疫苗 | 第23-24页 |
| ·基因疫苗 | 第24页 |
| ·病毒样颗粒疫苗 | 第24-25页 |
| ·NP 蛋白的研究进展 | 第25-28页 |
| ·NP 与 RNA 聚合酶的作用 | 第26页 |
| ·NP 寡聚化对形成RNP 复合体的作用 | 第26-27页 |
| ·NP 的核转运功能 | 第27-28页 |
| ·本研究的目的意义 | 第28-29页 |
| 第一部分 NP 突变体抑制流感病毒复制的机制 | 第29-72页 |
| 2 实验一 NP 突变体的构建及突变体对野生NP 功能的影响 | 第29-45页 |
| ·材料与方法 | 第29-39页 |
| ·质粒、细胞、感受态 | 第29-30页 |
| ·实验主要仪器 | 第30-31页 |
| ·主要试剂 | 第31-32页 |
| ·pCAGGs-NP 的构建 | 第32页 |
| ·NP 基因的突变 | 第32-35页 |
| ·野生和突变体 NP 真核表达载体的构建 | 第35-38页 |
| ·微复制系统检测NP 突变体对病毒RNA 转录的影响 | 第38-39页 |
| ·结果 | 第39-43页 |
| ·突变体阳性质粒PCR 鉴定结果 | 第40页 |
| ·突变质粒酶切鉴定 | 第40页 |
| ·pPolI-PR8-NA-firefly-luciferase 质粒的鉴定 | 第40-42页 |
| ·Luciferase 检测结果 | 第42-43页 |
| ·讨论 | 第43-45页 |
| 3 实验二 突变体 NP 与野生NP 之间相互作用研究 | 第45-59页 |
| ·材料与方法 | 第46-51页 |
| ·质粒、细胞 | 第46页 |
| ·含标签蛋白突变体的构建与鉴定 | 第46-48页 |
| ·免疫共沉淀法研究突变体 NP-NP 相互作用 | 第48-49页 |
| ·免疫共沉淀法研究突变体与野生NP 间的相互作用 | 第49-50页 |
| ·突变体或野生 NP 作用形成多聚体在蔗糖中分布 | 第50-51页 |
| ·结果 | 第51-57页 |
| ·带标签蛋白突变体的构建结果 | 第51-54页 |
| ·免疫共沉淀法检测NP 蛋白间的相互作用 | 第54-55页 |
| ·WB 检测突变体或野生 NP 相互作用在蔗糖梯度中存分布 | 第55-57页 |
| ·讨论 | 第57-59页 |
| 4 实验三 NP-NP 相互作用在细胞中定位及突变体对病毒复制的影响 | 第59-71页 |
| ·材料与方法 | 第59-62页 |
| ·质粒、鸡胚、病毒株、试剂 | 第59页 |
| ·瞬时转染检测突变核定位信号NP 在细胞中的定位 | 第59页 |
| ·稳定表达 NPA387R 和 NP387-delNLS1&mutNLS2 细胞系的构建 | 第59-61页 |
| ·NP 突变体在稳定表达细胞系中的定位 | 第61页 |
| ·细胞系 MDCK-NPA387R 和MDCK- NP387-delNLS1&mutNLS2 转录病毒 RNA 检测 | 第61页 |
| ·PR8 病毒在MDCK-NPA387R 和 MDCK- NP387-delNLS1&mutNLS2 生长 | 第61-62页 |
| ·结果 | 第62-69页 |
| ·瞬时转染突变体 NP387-delNLS1&mutNLS2 在细胞中的定位 | 第62页 |
| ·稳定表达细胞系 MDCK-NPA387R 和 MDCK- NP387-delNLS1&mutNLS2 建立结果 | 第62-66页 |
| ·NP387-delNLS1&mutNLS2 和NPA387R 蛋白在细胞系中定位 | 第66-67页 |
| ·突变体细胞系对病毒 RNA 转录的影响 | 第67页 |
| ·突变体细胞系对 PR8 病毒复制的影响 | 第67-69页 |
| ·讨论 | 第69-71页 |
| 第一部分小结 | 第71-72页 |
| 第二部分 A 型流感病毒病毒样颗粒形成的关键结构蛋白研究 | 第72-86页 |
| 5 实验四 同时表达三个外源基因真核表达载体pCAGGs-IRES 的功能验证 | 第73-78页 |
| ·材料与方法 | 第73-75页 |
| ·质粒、大肠杆菌感受态细胞及真核细胞 | 第73页 |
| ·主要试剂 | 第73页 |
| ·引物的设计合成 | 第73-74页 |
| ·插入三个外源基因载体pCAGGs-IRES-HA-M-GFP 的构建 | 第74页 |
| ·载体pCAGGs-IRES 各启动子功能的验证 | 第74-75页 |
| ·结果 | 第75-76页 |
| ·瞬时转染鉴定 IRES 下游 EGFP 基因表达 | 第75页 |
| ·间接免疫荧光鉴定 SV40 启动下游 M 基因表达 | 第75页 |
| ·Western blot 鉴定β-actin 启动子下游的 HA 基因表达 | 第75-76页 |
| ·讨论 | 第76-78页 |
| 6 实验五 流感病毒病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究 | 第78-85页 |
| ·材料与方法 | 第78-80页 |
| ·质粒、大肠杆菌感受态细胞、真核细胞及病毒 | 第78页 |
| ·主要试剂 | 第78页 |
| ·引物的设计合成 | 第78页 |
| ·表达 H5-HA 蛋白质粒pCAGGs-IRES-HA 的构建 | 第78页 |
| ·表达 HA、NA 蛋白质粒pCAGGs-IRES-HA-NA 的构建 | 第78-79页 |
| ·表达 HA、NA、M1 蛋白质粒pCAGGs-IRES-HA-NA-M1 构建 | 第79页 |
| ·间接免疫荧光检测 M1 基因表达 | 第79-80页 |
| ·血凝活性检测病毒样颗粒包装 | 第80页 |
| ·透射电子显微镜观察病毒样颗粒形态 | 第80页 |
| ·结果 | 第80-84页 |
| ·质粒pCAGGs-IRES-HA 鉴定 | 第80页 |
| ·质粒pCAGGs-IRES-HA-NA 鉴定 | 第80页 |
| ·质粒pCAGGs-IRES-HA-NA-M1 鉴定 | 第80-82页 |
| ·间接免疫荧光鉴定M1 的表达情况 | 第82页 |
| ·血凝试验初步检测病毒样颗粒包装结果 | 第82-83页 |
| ·透射电子显微镜观察流感病毒病毒样颗粒结果 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-85页 |
| 第二部分小结 | 第85-86页 |
| 7 结论 | 第86页 |
| 8 展望 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-98页 |
| 作者简介 | 第98页 |
