| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 缩写符号术语表 | 第13-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-41页 |
| 1.1 腈类化合物及其水解 | 第19-20页 |
| 1.1.1 腈类化合物 | 第19页 |
| 1.1.2 腈类化合物的水解 | 第19-20页 |
| 1.2 腈水合酶 | 第20-29页 |
| 1.2.1 腈水合酶的来源与种类 | 第20-22页 |
| 1.2.2 腈水合酶基因序列和蛋白结构特征 | 第22-23页 |
| 1.2.3 腈水合酶的反应机理 | 第23-24页 |
| 1.2.4 腈水合酶的选择性 | 第24-25页 |
| 1.2.5 腈水合酶的重组表达 | 第25-27页 |
| 1.2.6 腈水合酶翻译后修饰 | 第27页 |
| 1.2.7 腈水合酶的应用 | 第27-29页 |
| 1.3 酰胺酶 | 第29-36页 |
| 1.3.1 酰胺酶的来源及分类 | 第30-31页 |
| 1.3.2 酰胺酶催化反应的机理 | 第31-33页 |
| 1.3.3 酰胺酶的立体选择性 | 第33页 |
| 1.3.4 酰胺酶的重组表达 | 第33-34页 |
| 1.3.5 酰胺酶在手性中间体合成中的应用 | 第34-36页 |
| 1.4 腈水合酶和酰胺酶的耦合催化 | 第36页 |
| 1.5 氰戊菊酯 | 第36-38页 |
| 1.6 本课题的研究思路与主要内容 | 第38-41页 |
| 第二章 腈水合酶基因克隆及其功能表达 | 第41-57页 |
| 2.1 前言 | 第41页 |
| 2.2 材料与方法 | 第41-50页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第41页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.2.3 宿主菌和质粒 | 第42页 |
| 2.2.4 培养基的配制和培养条件 | 第42页 |
| 2.2.5 野生菌株活化及基因组的提取 | 第42-44页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第44页 |
| 2.2.7 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第44页 |
| 2.2.8 腈水合酶氨基酸序列比对及分子探针的设计 | 第44-45页 |
| 2.2.9 钴型腈水合酶基因信息的搜索 | 第45页 |
| 2.2.10 钴型腈水合酶基因的选择 | 第45页 |
| 2.2.11 腈水合酶基因的克隆 | 第45-47页 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 | 第47页 |
| 2.2.13 重组质粒的转化和阳性转化子的验证 | 第47-48页 |
| 2.2.14 腈水合酶的重组表达 | 第48页 |
| 2.2.15 重组腈水合酶的酶活测定 | 第48-50页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第50-55页 |
| 2.3.1 钴型腈水合酶的多序列比对 | 第50-51页 |
| 2.3.2 钴型腈水合酶保守序列分析和虚拟腈水合酶基因库的建立 | 第51-54页 |
| 2.3.3 钴型腈水合酶基因目标的选定 | 第54页 |
| 2.3.4 工程菌的构建及重组酶蛋白的表达 | 第54-55页 |
| 2.4 小结 | 第55-57页 |
| 第三章 腈水合酶NHaseK的高效功能表达及其酶学特性 | 第57-85页 |
| 3.1 前言 | 第57页 |
| 3.2 材料与方法 | 第57-69页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第57-58页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第58页 |
| 3.2.3 主要试剂及溶液配制方法 | 第58页 |
| 3.2.4 菌株和质粒 | 第58页 |
| 3.2.5 培养基的配制和培养条件 | 第58-59页 |
| 3.2.6 腈水合酶NHaseK基因的克隆和重组质粒的构建 | 第59-60页 |
| 3.2.7 活化元件对NHaseK重组表达和其酶活的影响 | 第60页 |
| 3.2.8 表达元件的重新设计 | 第60-61页 |
| 3.2.9 重组质粒的转化和阳性转化子的验证 | 第61-62页 |
| 3.2.10 重组腈水合酶NHaseK的诱导表达 | 第62页 |
| 3.2.11 钴离子对细胞生长和重组NHaseK表达量的影响 | 第62页 |
| 3.2.12 菌体收集和细胞破碎 | 第62页 |
| 3.2.13 蛋白质SDS-PAGE电泳 | 第62-64页 |
| 3.2.14 蛋白浓度的测定 | 第64-65页 |
| 3.2.15 重组腈水合酶NHaseK的纯化 | 第65-66页 |
| 3.2.16 重组NHaseK活力的测定 | 第66-68页 |
| 3.2.17 重组NHaseK酶学特性的研究 | 第68-69页 |
| 3.2.17.1 温度、pH对重组NHaseK酶活性及稳定性的影响 | 第68-69页 |
| 3.2.17.2 金属离子和化合物对重组NHaseK活力的影响 | 第69页 |
| 3.2.17.3 NHaseK的底物谱 | 第69页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第69-83页 |
| 3.3.1 基因组DNA的提取和腈水合酶基因片段的扩增 | 第69-71页 |
| 3.3.2 重组菌的构建及NHaseK的重组表达 | 第71-72页 |
| 3.3.3 17K对重组NHaseK功能表达的影响 | 第72-74页 |
| 3.3.4 重构NHaseK的表达元件 | 第74-77页 |
| 3.3.5 钻离子对NHaseK重组表达的影响 | 第77-78页 |
| 3.3.6 重组腈水合酶NHaseK的纯化 | 第78-79页 |
| 3.3.7 重组NHaseK的酶学性质研究 | 第79-83页 |
| 3.3.7.1 pH对重组NHaseK的影响 | 第79-80页 |
| 3.3.7.2 温度对重组NHaseK的影响 | 第80-81页 |
| 3.3.7.3 金属离子和化合物对重组NHaseK酶活力的影响 | 第81-82页 |
| 3.3.7.4 重组腈水合酶NHaseK的底物谱 | 第82-83页 |
| 3.4 本章小结 | 第83-85页 |
| 第四章 酰胺酶基因克隆及其功能表达 | 第85-107页 |
| 4.1 前言 | 第85-86页 |
| 4.2 材料与方法 | 第86-94页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第86页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第86页 |
| 4.2.3 宿主菌和质粒 | 第86页 |
| 4.2.4 培养基配制和培养条件 | 第86页 |
| 4.2.5 酰胺酶基因的克隆和重组质粒的构建 | 第86-88页 |
| 4.2.6 酰胺酶的重组表达 | 第88-89页 |
| 4.2.7 表达载体对酰胺酶KamH重组表达的影响 | 第89页 |
| 4.2.8 基因簇中其它基因对kamH重组表达的影响 | 第89-91页 |
| 4.2.9 融合标签种类及其位置对KamH重组表达的影响 | 第91页 |
| 4.2.10 酰胺酶功能表达策略的验证 | 第91页 |
| 4.2.11 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定 | 第91-92页 |
| 4.2.12 重组酰胺酶活力的测定 | 第92-94页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第94-105页 |
| 4.3.1 酰胺酶的重组表达 | 第94-96页 |
| 4.3.2 表达载体对KamH重组表达的影响 | 第96页 |
| 4.3.3 基因簇中其它基因对KamH重组表达的影响 | 第96-99页 |
| 4.3.4 重组KamH的纯化及N端多肽的切除 | 第99-101页 |
| 4.3.5 重组表达不带融合标签的KamH | 第101-102页 |
| 4.3.6 融合标签类型及其位置对KamH重组表达的影响 | 第102页 |
| 4.3.7 酰胺酶功能表达策略验证 | 第102-105页 |
| 4.4 本章小结 | 第105-107页 |
| 第五章 KamH的产酶条件优化及其酶学特性 | 第107-133页 |
| 5.1 前言 | 第107页 |
| 5.2 材料与方法 | 第107-111页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第107页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第107页 |
| 5.2.3 质粒与菌种 | 第107-108页 |
| 5.2.4 培养基配制和培养条件 | 第108页 |
| 5.2.5 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定 | 第108页 |
| 5.2.6 重组KamH活性及其对映体选择性的测定 | 第108页 |
| 5.2.7 KamH的产酶条件优化 | 第108页 |
| 5.2.8 KamH酶学性质的研究 | 第108-109页 |
| 5.2.8.1 温度、pH对KamH酶活及稳定性的影响 | 第108页 |
| 5.2.8.2 金属离子及表面活性剂对酰胺酶KamH活性的影响 | 第108-109页 |
| 5.2.8.3 有机溶剂对酰胺酶KamH活力的影响 | 第109页 |
| 5.2.8.4 底物浓度对酰胺酶KamH活性的影响及其动力学参数 | 第109页 |
| 5.2.8.5 酰胺酶KamH的底物谱 | 第109页 |
| 5.2.9 酰胺酶KamH拆分CPIAm的研究 | 第109页 |
| 5.2.10 酰胺酶KamH蛋白的基本理化性质分析 | 第109-110页 |
| 5.2.11 酰胺酶KamH的保守氨基酸序列分析 | 第110页 |
| 5.2.12 酰胺酶KamH的同源模建 | 第110-111页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第111-131页 |
| 5.3.1 工程菌K-5发酵产酶培养基组分的优化 | 第111-113页 |
| 5.3.1.1 碳源对K-5发酵产酶的影响 | 第111页 |
| 5.3.1.2 氮源对K-5发酵产酶的影响 | 第111-112页 |
| 5.3.1.3 微量金属元素对K-5发酵产酶的影响 | 第112-113页 |
| 5.3.2 工程菌K-5发酵产酶诱导条件优化 | 第113-116页 |
| 5.3.2.1 诱导温度对发酵产酶的影响 | 第113-114页 |
| 5.3.2.2 诱导起始菌浓对发酵产酶的影响 | 第114页 |
| 5.3.2.3 IPTG浓度对发酵产酶的影响 | 第114-115页 |
| 5.3.2.4 诱导时长对发酵产酶的影响 | 第115-116页 |
| 5.3.3 重组酰胺酶KamH酶学特性的研究 | 第116-125页 |
| 5.3.3.1 pH对酰胺酶KamH活力的影响 | 第116页 |
| 5.3.3.2 pH对酰胺酶KamH稳定性的影响 | 第116-117页 |
| 5.3.3.3 温度对酰胺酶KamH活力的影响 | 第117-118页 |
| 5.3.3.4 酰胺酶KamH的温度稳定性 | 第118-120页 |
| 5.3.3.5 金属离子及表面活性剂对KamH活力的影响 | 第120页 |
| 5.3.3.6 有机溶剂对KamH活力的影响 | 第120-122页 |
| 5.3.3.7 底物浓度对KamH活力的影响及酶的动力学参数 | 第122-123页 |
| 5.3.3.8 酰胺酶KamH的底物特异性 | 第123-125页 |
| 5.3.4 酰胺酶KamH拆分CPIAm的过程 | 第125页 |
| 5.3.5 酰胺酶KamH氨基酸序列特征及进化树分析 | 第125-126页 |
| 5.3.6 酰胺酶KamH的保守氨基酸序列分析 | 第126-128页 |
| 5.3.7 同源模建及KamH蛋白空间结构分析 | 第128-131页 |
| 5.4 本章小结 | 第131-133页 |
| 第六章 双酶共表达体系的构建及耦合催化的初步研究 | 第133-147页 |
| 6.1 前言 | 第133页 |
| 6.2 材料与方法 | 第133-137页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第133页 |
| 6.2.2 主要试剂 | 第133页 |
| 6.2.3 宿主菌和质粒 | 第133-134页 |
| 6.2.4 NHaseK和KamH的共表达 | 第134页 |
| 6.2.5 单质粒共表达体系的构建 | 第134-135页 |
| 6.2.6 双质粒共表达体系的构建 | 第135页 |
| 6.2.7 双酶共表达体系的诱导表达 | 第135页 |
| 6.2.8 蛋白质SDS-PAGE电泳及蛋白浓度的测定 | 第135页 |
| 6.2.9 重组腈水合酶和酰胺酶活力的测定 | 第135-136页 |
| 6.2.10 一菌多酶偶联催化CPIN的研究 | 第136页 |
| 6.2.11 双菌双酶偶联催化CPIN的研究 | 第136-137页 |
| 6.2.12 双菌细胞比例对偶联催化CPIN的影响 | 第137页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第137-145页 |
| 6.3.1 单质粒共表达体系的构建 | 第137-138页 |
| 6.3.2 pETDuet-N-K单质粒共表达体系的分析 | 第138页 |
| 6.3.3 pRSFDuet-N-K单质粒共表达体系的分析 | 第138-139页 |
| 6.3.4 pCDFDuet-N-K单质粒共表达体系的分析 | 第139-140页 |
| 6.3.5 pETDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析 | 第140-141页 |
| 6.3.6 pRSFDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析 | 第141-142页 |
| 6.3.7 pCDFDuet-N+pET-A双质粒共表达体系的分析 | 第142-143页 |
| 6.3.8 不同偶联催化策略的比较 | 第143-144页 |
| 6.3.9 双菌细胞量比例对偶联催化CPIN的影响 | 第144-145页 |
| 6.4 本章小结 | 第145-147页 |
| 第七章 结论与展望 | 第147-152页 |
| 7.1 结论 | 第147-150页 |
| 7.2 论文的创新点 | 第150-151页 |
| 7.3 展望 | 第151-152页 |
| 参考文献 | 第152-177页 |
| 附录 | 第177-198页 |
| 作者简介及博士期间的研究成果 | 第198页 |
