| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 1 文献综述 | 第12-21页 |
| 1.1 松材线虫病及松材线虫基础生物学研究进展 | 第12-14页 |
| 1.2 线虫dauer型幼虫形成机制研究进展 | 第14-17页 |
| 1.2.1 松材线虫dauer型幼虫形成机制研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2.2 其它线虫dauer型幼虫形成机制研究进展 | 第15-17页 |
| 1.3 dauer型幼虫形成相关基因akt-1研究进展 | 第17-18页 |
| 1.4 dauer型幼虫形成相关基因daf-8研究进展 | 第18-19页 |
| 1.5 研究的目的和意义 | 第19-21页 |
| 2 实验材料与方法 | 第21-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 供试线虫的培养与收集 | 第21页 |
| 2.1.2 供试菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第21页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第21-22页 |
| 2.1.5 所用培养基 | 第22页 |
| 2.1.6 所需溶液配制 | 第22-23页 |
| 2.2 实验方法 | 第23-40页 |
| 2.2.1 繁殖周期的不同发育时期的同步松材线虫的获得 | 第23-24页 |
| 2.2.1.1 松材线虫同步胚胎的获得 | 第23页 |
| 2.2.1.2 各发育时期的同步松材线虫的获得 | 第23-24页 |
| 2.2.2 松材线虫akt-1和daf-8基因的克隆 | 第24-28页 |
| 2.2.2.1 松材线虫总RNA的提取与检测 | 第24页 |
| 2.2.2.2 松材线虫总RNA反转录 | 第24-25页 |
| 2.2.2.3 PCR扩增目的基因 | 第25-26页 |
| 2.2.2.4 目的片段回收 | 第26页 |
| 2.2.2.5 重组质粒的构建 | 第26-27页 |
| 2.2.2.6 重组质粒导入大肠杆菌 | 第27页 |
| 2.2.2.7 重组子的筛选 | 第27-28页 |
| 2.2.2.8 质粒提取 | 第28页 |
| 2.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因不同龄期实时定量PCR(qPCR)分析 | 第28-30页 |
| 2.2.3.1 松材线虫qPCR模板的制备 | 第28-29页 |
| 2.2.3.2 不同龄期松材线虫akt-1、daf-8基因的qPCR分析 | 第29-30页 |
| 2.2.4 松材线虫akt-1和daf-8基因原位杂交实验（in situ hybridization） | 第30-34页 |
| 2.2.4.1 原位杂交探针的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.4.2 松材线虫的固定 | 第31-33页 |
| 2.2.4.3 杂交与检测 | 第33-34页 |
| 2.2.5 松材线虫akt-1和daf-8基因在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第34-37页 |
| 2.2.5.1 松材线虫akt-1和daf-8基因启动子表达载体构建 | 第34-36页 |
| 2.2.5.2 松材线虫akt-1和daf-8基因启动子表达载体的显微注射 | 第36-37页 |
| 2.2.6 松材线虫akt-1和daf-8基因RNA干扰（RNAi）实验 | 第37-40页 |
| 2.2.6.1 akt-1和daf-8基因含T7启动子干扰片段的获得 | 第37页 |
| 2.2.6.2 dsRNA的制备 | 第37-38页 |
| 2.2.6.3 RNAi浸泡实验 | 第38-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-57页 |
| 3.1 松材线虫akt-1和daf-8基因克隆 | 第40-41页 |
| 3.1.1 松材线虫总RNA提取 | 第40页 |
| 3.1.2 PCR扩增松材线虫akt-1和daf-8基因 | 第40-41页 |
| 3.1.3 重组子筛选 | 第41页 |
| 3.2 松材线虫akt-1和daf-8基因的表达研究 | 第41-54页 |
| 3.2.1 松材线虫akt-1和daf-8基因实时定量PCR | 第41-45页 |
| 3.2.1.1 松材线虫不同龄期同步线虫总RNA提取 | 第41-42页 |
| 3.2.1.2 实时定量PCR引物设计 | 第42页 |
| 3.2.1.3 松材线虫akt-1和daf-8基因不同发育时期qPCR分析 | 第42-45页 |
| 3.2.2 松材线虫akt-1和daf-8基因In situ hybridization | 第45-46页 |
| 3.2.2.1 松材线虫akt-1和daf-8基因克隆 | 第45页 |
| 3.2.2.2 PCR扩增含SP6及T7启动子的目的片段 | 第45-46页 |
| 3.2.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因原位杂交实验 | 第46页 |
| 3.2.3 松材线虫akt-1和daf-8基因在秀丽隐杆线虫体内的转基因表达 | 第46-54页 |
| 3.2.3.1 松材线虫akt-1和daf-8基因的转基因表达载体构建图 | 第46-47页 |
| 3.2.3.2 PCR扩增载体片段 | 第47-48页 |
| 3.2.3.3 PCR扩增松材线虫akt-1和daf-8基因启动子区域 | 第48-49页 |
| 3.2.3.4 In-fusion Cloning | 第49页 |
| 3.2.3.5 秀丽隐杆线虫转基因F2代荧光观察 | 第49-54页 |
| 3.3 松材线虫akt-1和daf-8基因RNA干扰实验 | 第54-57页 |
| 3.3.1 PCR扩增akt-1和daf-8基因含T7启动子干扰片段 | 第54页 |
| 3.3.2 RNAi浸泡实验 | 第54-57页 |
| 3.3.2.1 同步卵11 h、卵18 h RNAi浸泡实验 | 第54-56页 |
| 3.3.2.2 同步L2幼虫RNAi浸泡实验 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| 5 结论与展望 | 第61-63页 |
| 5.1 结论 | 第61页 |
| 5.2 展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-74页 |
| 个人简介 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
