| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 1 前言 | 第9-22页 |
| 1.1 兽疫链球菌 | 第9页 |
| 1.2 兽疫链球菌发酵生产透明质酸 | 第9-11页 |
| 1.2.1 透明质酸合成途径 | 第9-10页 |
| 1.2.2 发酵条件 | 第10-11页 |
| 1.2.3 透明质酸合成与分泌机制 | 第11页 |
| 1.3 兽疫链球菌基因功能研究进展 | 第11-12页 |
| 1.4 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶研究进展 | 第12-16页 |
| 1.4.1 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶作用机制 | 第12-13页 |
| 1.4.2 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的生物学功能 | 第13-14页 |
| 1.4.3 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的同源性及拷贝数分析 | 第14-15页 |
| 1.4.4 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶三维结构分析 | 第15-16页 |
| 1.5 基因敲除技术 | 第16-19页 |
| 1.5.1 基因敲除技术原理 | 第16-17页 |
| 1.5.2 基因敲除策略 | 第17-19页 |
| 1.5.3 基因敲除技术的应用 | 第19页 |
| 1.6 大肠杆菌重组蛋白表达系统 | 第19-20页 |
| 1.7 本课题的研究思路 | 第20-22页 |
| 1.7.1 研究背景及意义 | 第20页 |
| 1.7.2 研究内容 | 第20-22页 |
| 2. 材料与方法 | 第22-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-28页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第22页 |
| 2.1.2 工具酶及相关试剂 | 第22-24页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第24-25页 |
| 2.1.4 培养基和主要溶液 | 第25-28页 |
| 2.2 实验方法 | 第28-45页 |
| 2.2.1 兽疫链球菌基因组DNA的提取 | 第28页 |
| 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳 | 第28-29页 |
| 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.2.4 敲除载体pLH70的构建 | 第29-33页 |
| 2.2.5 敲除载体pLH75的构建 | 第33-34页 |
| 2.2.6 兽疫链球菌感受态的制备及电转化 | 第34-35页 |
| 2.2.7 敲除菌株的筛选及鉴定 | 第35-36页 |
| 2.2.8 兽疫链球菌总RNA的提取及RT-PCR | 第36-38页 |
| 2.2.9 HasC1、HasC2蛋白表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.10 HasC1、HasC2蛋白的诱导表达、纯化及酶活测定 | 第39-42页 |
| 2.2.11 兽疫链球菌代谢产物的分析测定 | 第42-45页 |
| 3 结果与讨论 | 第45-65页 |
| 3.1 S.zooepidemicus ATCC39920 UGPase基因的克隆与分离 | 第45-47页 |
| 3.2 UGPase基因转录水平分析 | 第47-48页 |
| 3.2.1 S.zooepidemicus总RNA的提取 | 第47-48页 |
| 3.2.2 hasC1和hasC2基因的反转录及表达水平 | 第48页 |
| 3.3 S.zooepidemicus基因组DNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.4 敲除载体pLH70、pLH75的构建 | 第49-52页 |
| 3.5.1 hasC1敲除载体pLH70的构建 | 第49-50页 |
| 3.5.2 hasC2敲除载体pLH75的构建 | 第50-52页 |
| 3.5 敲除菌株的构建及鉴定 | 第52-54页 |
| 3.5.1 hasC1敲除菌株的构建及鉴定 | 第52页 |
| 3.5.2 hasC2敲除菌株的构建及鉴定 | 第52-53页 |
| 3.5.3 hasC1/hasC2双敲除菌株的构建及鉴定 | 第53-54页 |
| 3.6 S.zooepidemicus野生型与突变菌株的表型分析 | 第54-56页 |
| 3.6.1 S.zooepidemicus野生型与突变菌株的表型分析 | 第54-55页 |
| 3.6.2 S.zooepidemicus野生型与突变菌株在不同碳源条件下的生长情况 | 第55-56页 |
| 3.7 HasC1、HasC2结构预测及同源建模 | 第56-57页 |
| 3.8 HasC1、HasC2在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化及酶活分析 | 第57-60页 |
| 3.8.1 HasC1、HasC2表达载体的构建 | 第57-58页 |
| 3.8.2 HasC1、HasC2蛋白的表达及纯化 | 第58-59页 |
| 3.8.3 HasC1、HasC2蛋白酶活测定 | 第59-60页 |
| 3.9 兽疫链球菌代谢过程参数监测 | 第60-65页 |
| 3.9.1 生长曲线的测定 | 第60-61页 |
| 3.9.2 乳酸含量的测定 | 第61页 |
| 3.9.3 HA含量的测定 | 第61-62页 |
| 3.9.4 蔗糖含量的测定 | 第62-63页 |
| 3.9.5 胞内代谢产物的分析 | 第63-65页 |
| 4 结论 | 第65-66页 |
| 5 展望 | 第66-67页 |
| 6 参考文献 | 第67-75页 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 | 第75-76页 |
| 8 致谢 | 第76页 |
