| 摘要 | 第6-7页 |
| abstract | 第7页 |
| 英文缩略表 | 第11-12页 |
| 第一章 引言 | 第12-21页 |
| 1.1 伪狂犬病毒概况 | 第12-15页 |
| 1.1.1 PRV的病原特性 | 第12页 |
| 1.1.2 PRV分子生物学特性 | 第12-13页 |
| 1.1.3 PRV的潜伏感染性 | 第13-14页 |
| 1.1.4 PRV疫苗制备方法研究进展 | 第14-15页 |
| 1.2 腺病毒表达系统 | 第15-17页 |
| 1.2.1 腺病毒的形态结构与功能 | 第15-16页 |
| 1.2.2 腺病毒载体包装方法 | 第16页 |
| 1.2.3 腺病毒表达载体应用 | 第16-17页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统 | 第17-19页 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas系统的来源 | 第17页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas系统的结构与组成 | 第17-18页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制 | 第18-19页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统的研究进展 | 第19页 |
| 1.4 研究的目的与意义 | 第19-21页 |
| 第二章 表达Cas9蛋白重组腺病毒的构建 | 第21-28页 |
| 2.1 材料与方法 | 第21-24页 |
| 2.1.1 材料 | 第21页 |
| 2.1.2 Cas9基因的扩增 | 第21-22页 |
| 2.1.3 重组穿梭质粒的构建 | 第22-23页 |
| 2.1.4 重组质粒的酶切鉴定 | 第23页 |
| 2.1.5 重组腺病毒的包装 | 第23-24页 |
| 2.1.6 重组腺病毒终点稀释法测滴度 | 第24页 |
| 2.1.7 Western blot鉴定重组腺病毒表达的Cas9蛋白 | 第24页 |
| 2.2 结果 | 第24-26页 |
| 2.2.1 重组穿梭质粒的构建 | 第24-25页 |
| 2.2.2 重组腺病毒的包装与鉴定 | 第25页 |
| 2.2.3 重组腺病毒滴度测定结果 | 第25-26页 |
| 2.2.4 Western blot鉴定重组腺病毒表达的Cas9蛋白 | 第26页 |
| 2.3.讨论 | 第26-28页 |
| 第三章 伪狂犬病毒基因缺失株的构建及其生物学特性分析 | 第28-41页 |
| 3.1 材料与方法 | 第28-33页 |
| 3.1.1 病毒株、载体、菌种、细胞、主要试剂极其溶液的配制 | 第28页 |
| 3.1.2 主要仪器设备 | 第28-29页 |
| 3.1.3 分子生物学软件 | 第29页 |
| 3.1.4 SgRNA靶点的设计与寡核苷酸链的合成 | 第29页 |
| 3.1.5 穿梭载体的构建 | 第29-30页 |
| 3.1.6 TK基因的敲除 | 第30-33页 |
| 3.1.7 gE基因的敲除 | 第33页 |
| 3.1.8 重组病毒生长特性鉴定 | 第33页 |
| 3.1.9 小鼠攻毒实验 | 第33页 |
| 3.1.10 病理切片观察 | 第33页 |
| 3.2 结果 | 第33-39页 |
| 3.2.1 SgRNA穿梭质粒的构建 | 第33-34页 |
| 3.2.2 Vero细胞病变 | 第34-35页 |
| 3.2.3 TK基因突变情况检测 | 第35页 |
| 3.2.4 测序鉴定与稳定缺失株的获得 | 第35-36页 |
| 3.2.5 Vero细胞病变 | 第36-37页 |
| 3.2.6 gE基因突变位点附近基因PCR扩增及测序 | 第37-38页 |
| 3.2.7 重组毒株的生长特性鉴定 | 第38页 |
| 3.2.8 小鼠攻毒实验结果 | 第38页 |
| 3.2.9 病理切片观察 | 第38-39页 |
| 3.3 讨论 | 第39-41页 |
| 第四章 表达EGFP基因重组伪狂犬病毒的构建 | 第41-46页 |
| 4.1 材料与方法 | 第41-43页 |
| 4.1.1 病毒株、载体、菌种、细胞 | 第41页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第41页 |
| 4.1.3 寡核苷酸链的合成与载体的构建 | 第41-42页 |
| 4.1.4 重组穿梭质粒的构建 | 第42页 |
| 4.1.5 细胞培养与转染 | 第42-43页 |
| 4.1.6 重组伪狂犬病毒的鉴定与筛选 | 第43页 |
| 4.2 结果 | 第43-45页 |
| 4.2.1 基因插入的技术路线与EGFP基因的扩增 | 第43页 |
| 4.2.2 重组穿梭质粒的构建 | 第43-44页 |
| 4.2.3 重组病毒感染细胞荧光蛋白表达与鉴定 | 第44-45页 |
| 4.3 讨论 | 第45-46页 |
| 第五章 全文总结 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-52页 |
| 致谢 | 第52-53页 |
| 作者简介 | 第53页 |
