| 中文摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-22页 |
| 1 PsaA 的结构 | 第14页 |
| 2 功能 | 第14-16页 |
| 3 重组PsaA 蛋白 | 第16-17页 |
| 4 应用前景 | 第17-20页 |
| 5 结论 | 第20-22页 |
| 第二章 肺炎链球菌psaA 基因在E. coli 中的克隆表达 | 第22-37页 |
| 1 引言 | 第22-23页 |
| 2 材料 | 第23页 |
| ·菌体及抗体 | 第23页 |
| ·主要试剂及工具酶 | 第23页 |
| ·主要仪器设备 | 第23页 |
| 3 方法 | 第23-30页 |
| ·肺炎链球菌基因组的提取 | 第23-24页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第24-25页 |
| ·引物设计 | 第24页 |
| ·PCR 反应体系 | 第24页 |
| ·PCR 反应条件 | 第24页 |
| ·PCR 产物的浓缩 | 第24-25页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第25页 |
| ·质粒转化 | 第25页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第25-26页 |
| ·双酶切质粒和目的基因片段 | 第26-27页 |
| ·DNA 凝胶回收 | 第27页 |
| ·目的基因片段与载体的连接 | 第27页 |
| ·重组质粒pET28a-psaA 的鉴定 | 第27-28页 |
| ·酶切鉴定 | 第27-28页 |
| ·序列测定 | 第28页 |
| ·诱导表达rPsaA 蛋白 | 第28-29页 |
| ·PsaA 蛋白的小量诱导表达 | 第28页 |
| ·PsaA 蛋白的大量诱导表达 | 第28-29页 |
| ·rPsaA 蛋白的纯化 | 第29页 |
| ·rPsaA 纯化条件的优化 | 第29页 |
| ·rPsaA 蛋白的纯化 | 第29页 |
| ·rPsaA 蛋白的透析 | 第29页 |
| ·rPsaA 蛋白浓度的测定 | 第29页 |
| ·Western-blot 鉴定PsaA 蛋白中无组氨酸标签 | 第29-30页 |
| 4 结果 | 第30-35页 |
| 5 讨论 | 第35-36页 |
| 6 小结 | 第36-37页 |
| 第三章 重组PsaA 在结合疫苗中的应用 | 第37-54页 |
| 1 引言 | 第37-38页 |
| 2 材料 | 第38页 |
| 3 方法 | 第38-48页 |
| ·GAMP 的活化，衍生 | 第38-39页 |
| ·载体蛋白的制备 | 第39页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第39页 |
| ·rPsaA 的超滤浓缩 | 第39页 |
| ·凝胶层析 | 第39-40页 |
| ·GAMP-AH 和PsaA 的结合 | 第40-41页 |
| ·GAMP-PsaA 的纯化 | 第41页 |
| ·结合物纯化的预实验 | 第41页 |
| ·结合物的纯化 | 第41页 |
| ·GAMP-PsaA 的生化检测 | 第41-44页 |
| ·ADH 含量检测 | 第41-42页 |
| ·CNBr 残留量的检测 | 第42页 |
| ·多糖含量检测 | 第42-43页 |
| ·蛋白含量检测 | 第43页 |
| ·EDAC 残留量检测 | 第43-44页 |
| ·结合物分子大小分布，测KD 值 | 第44-45页 |
| ·衍生物与结合物原液的抗原性检测 | 第45-46页 |
| ·免疫双扩散法 | 第45页 |
| ·抑制ELISA | 第45-46页 |
| ·小鼠免疫原性实验 | 第46-48页 |
| ·免疫程序 | 第46页 |
| ·血清学检测 | 第46页 |
| ·直接法确定最佳酶标二抗工作浓度 | 第46-47页 |
| ·确定最佳包被浓度 | 第47页 |
| ·间接ELISA 测血清抗GAMP 特异性抗体水平 | 第47-48页 |
| ·ELISA 测血清抗TT 特异性抗体水平 | 第48页 |
| ·间接ELISA 测血清抗PsaA 特异性抗体水平 | 第48页 |
| 4 结果 | 第48-51页 |
| 5 讨论 | 第51-52页 |
| 6 小结 | 第52-54页 |
| 第四章 psaA 基因在毕赤酵母中的克隆表达 | 第54-64页 |
| 1 引言 | 第54-55页 |
| 2 方法 | 第55页 |
| ·菌体及抗体 | 第55页 |
| ·主要试剂及工具酶 | 第55页 |
| ·主要仪器设备 | 第55页 |
| 3 方法 | 第55-59页 |
| ·肺炎链球菌基因组的提取 | 第55页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第55-56页 |
| ·引物设计 | 第55-56页 |
| ·PCR 反应体系 | 第56页 |
| ·PCR 反应条件 | 第56页 |
| ·PCR 产物的浓缩 | 第56页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第56页 |
| ·质粒DNA 的提取 | 第56-57页 |
| ·双酶切质粒和目的基因片段 | 第57页 |
| ·DNA 凝胶回收 | 第57页 |
| ·目的基因片段与载体的连接 | 第57页 |
| ·重组质粒 | 第57-58页 |
| ·酶切鉴定 | 第57-58页 |
| ·序列测定 | 第58页 |
| ·重组质粒线性化 | 第58页 |
| ·酵母电转化 | 第58页 |
| ·高产量菌种的筛选 | 第58-59页 |
| ·小量发酵 | 第59页 |
| ·扩大发酵 | 第59页 |
| ·rPsaA 蛋白的纯化 | 第59页 |
| ·rPsaA 蛋白的透析 | 第59页 |
| ·rPsaA 蛋白浓度的测定 | 第59页 |
| 4 结果 | 第59-62页 |
| 5 讨论 | 第62-63页 |
| 6 小结 | 第63-64页 |
| 结论 | 第64-66页 |
| 1 已取得的成果 | 第64-65页 |
| 2 有待进行的研究 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-72页 |
| 附录一 缩略词中英文对照表 | 第72-74页 |
| 附录二 实验中使用的载体结构图 | 第74-76页 |
| 附录三 溶液的配制及仪器设备 | 第76-82页 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
