| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-43页 |
| 第一节 真核生物中的非编码小RNA 分子 | 第16-27页 |
| ·短的干扰小RNA (siRNA) | 第16-19页 |
| ·siRNA的发现 | 第16-18页 |
| ·siRNA介导RNA干扰的分子机制 | 第18-19页 |
| ·siRNA的功能 | 第19页 |
| ·微小RNA (microRNA) | 第19-23页 |
| ·miRNA的发现及其特性 | 第19-20页 |
| ·miRNA转录加工过程 | 第20-21页 |
| ·miRNA 的作用机制 | 第21-22页 |
| ·miRNA的生物学功能 | 第22-23页 |
| ·Piwi-interacting RNA (piRNA) | 第23-27页 |
| ·piRNA的发现及结构特征 | 第24-25页 |
| ·piRNA的生物起源 | 第25-27页 |
| ·piRNA 的生物学功能 | 第27页 |
| 第二节 原核生物中的非编码小RNA分子 | 第27-41页 |
| ·原核非编码小RNA分子分类 | 第28-30页 |
| ·具有酶活性或作为核蛋白组成部分的sRNA | 第29页 |
| ·和蛋白质相互作用影响蛋白质功能的sRNA | 第29-30页 |
| ·与靶RNA 配对结合调控目的基因表达的sRNA | 第30页 |
| ·与靶基因配对结合发挥功能的小RNA 分类 | 第30-31页 |
| ·非编码小RNA 的生物学功能 | 第31-39页 |
| ·RyhB | 第32-37页 |
| ·OxyS | 第37-38页 |
| ·DsrA | 第38页 |
| ·SgrS | 第38页 |
| ·Spot42 | 第38-39页 |
| ·Hfq 在非编码小RNA 调节过程中的作用 | 第39-41页 |
| ·Hfq的结构 | 第39-40页 |
| ·Hfq的作用机制 | 第40页 |
| ·Hfq的其他作用 | 第40-41页 |
| 第三节 真核生物与原核生物非编码小RNA 的比较 | 第41-43页 |
| 第二章 人工设计反式作用小RNA设计方法的建立 | 第43-50页 |
| 第一节 内源反式作用小RNA共同特征的分析 | 第43-46页 |
| 第二节 人工设计反式作用小RNA设计方法 | 第46-47页 |
| 第三节 讨论 | 第47-50页 |
| 第三章 针对特定基因的反式作用小 RNA 的设计和功能鉴定 | 第50-84页 |
| 第一节 针对外源基因EGFP 的反式作用小RNA 设计和功能鉴定 | 第50-65页 |
| ·材料与方法 | 第50-58页 |
| ·质粒和菌株 | 第50页 |
| ·构建载体所用引物序列 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50-51页 |
| ·常用缓冲液 | 第51-52页 |
| ·pET24a-EGFP 重组质粒的构建 | 第52-55页 |
| ·PBS-T7-EGFP重组质粒的构建 | 第55-56页 |
| ·重组质粒PBS-P1-EGFP的构建 | 第56页 |
| ·重组质粒pACYC-T7-EGFP和pACYC-P1-EGFP的构建 | 第56-57页 |
| ·针对报告基因EGFP设计并合成反式作用小RNA | 第57页 |
| ·人工设计反式作用小RNA功能鉴定 | 第57-58页 |
| ·实验结果 | 第58-65页 |
| ·pET24a-EGFP 重组质粒的构建 | 第58页 |
| ·PBS-T7-EGFP重组质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·重组质粒PBS-P1-EGFP的构建 | 第59-61页 |
| ·重组质粒pACYC-T7-EGFP和pACYC-P1-EGFP的构建 | 第61-62页 |
| ·针对报告基因EGFP设计并合成反式作用小RNA | 第62-64页 |
| ·人工设计反式作用小RNA功能鉴定 | 第64-65页 |
| 第二节 针对内源基因uidA的反式作用小RNA设计和功能鉴定 | 第65-71页 |
| ·材料与方法 | 第65-67页 |
| ·实验材料及主要仪器 | 第65-66页 |
| ·atsRNA的设计合成和atsRNA表达载体的构建 | 第66页 |
| ·atsRNA干扰效率的检测 | 第66-67页 |
| ·实验结果 | 第67-71页 |
| ·针对uidA基因的atsRNA设计和载体构建 | 第67-70页 |
| ·atsRNA干扰效率活性检测 | 第70-71页 |
| 第三节 atsRNA的体内表达检测 | 第71-78页 |
| ·材料和方法 | 第71-75页 |
| ·实验材料和主要仪器 | 第71页 |
| ·Northern探针的制备 | 第71-72页 |
| ·总RNA的提取 | 第72页 |
| ·atsRNA的电泳分离及Northern检测 | 第72-75页 |
| ·结果 | 第75-78页 |
| ·Northern探针的制备 | 第75页 |
| ·总RNA的提取 | 第75-77页 |
| ·Northern检测atsRNA体内表达 | 第77-78页 |
| 第四节 atsRNA引起的基因沉默特异性分析 | 第78-82页 |
| ·材料和方法 | 第78页 |
| ·GY系列atsRNA表达对uidA基因的作用 | 第78页 |
| ·CY 系列atsRNA 表达对EGFP 基因的作用 | 第78页 |
| ·atsRNA 表达后对对宿主细胞生长速度的影响 | 第78页 |
| ·结果 | 第78-82页 |
| ·GY系列atsRNA对uidA基因的作用 | 第78-79页 |
| ·CY 系列atsRNA 对EGFP 基因的作用 | 第79-80页 |
| ·atsRNA 表达后对对宿主细胞生长速度的影响 | 第80-82页 |
| 第五节 讨论 | 第82-84页 |
| 第四章 atsRNA 结构和功能关系研究 | 第84-108页 |
| 第一节 atsRNA 一级序列分析 | 第84-87页 |
| 第二节 atsRNA 二级结构分析 | 第87-99页 |
| ·实验材料和方法 | 第87-88页 |
| ·结果 | 第88-99页 |
| ·atsRNA二级结构分析 | 第88-89页 |
| ·靶基因配对区域中茎环结构功能的验证 | 第89-95页 |
| ·靶基因配对区域中Loop环内碱基个数的验证 | 第95-99页 |
| 第三节 稳定性对atsRNA干扰效率的影响 | 第99-105页 |
| ·实验材料和方法 | 第99-100页 |
| ·atsRNA CY1和CY9稳定性分析 | 第99-100页 |
| ·atsRNA突变体N-CY1设计及功能分析 | 第100页 |
| ·实验结果 | 第100-105页 |
| ·atsRNA CY1 和CY9 稳定性分析 | 第100-101页 |
| ·atsRNA突变体N-CY1设计及功能分析 | 第101-105页 |
| 第四节 讨论 | 第105-108页 |
| 第五章 atsRNA中各个组成部分的作用研究 | 第108-122页 |
| 第一节 实验材料和方法 | 第108-109页 |
| ·atsRNA靶基因配对结合区域缺失突变体 | 第108页 |
| ·atsRNA Hfq结合位点缺失突变体 | 第108页 |
| ·atsRNA 不依赖于Rho 因子转录终止末端功能分析 | 第108-109页 |
| ·atsRNA干扰效率检测及体内稳定性分析 | 第109页 |
| 第二节 实验结果 | 第109-120页 |
| ·atsRNA靶基因配对结合区域缺失突变体 | 第109-110页 |
| ·atsRNA Hfq结合位点缺失突变体 | 第110-112页 |
| ·atsRNA不依赖于Rho因子转录终止末端功能分析 | 第112-114页 |
| ·atsRNA干扰效率检测及体内稳定性分析 | 第114-120页 |
| 第三节 讨论 | 第120-122页 |
| 第六章 Hfq在atsRAN介导的基因沉默中的作用 | 第122-143页 |
| 第一节 实验材料和方法 | 第123-131页 |
| ·Hfq在atsRNA介导的基因沉默中的作用 | 第123-125页 |
| ·Hfq对atsRNA体内稳定性的影响 | 第125页 |
| ·Hfq与atsRNA在体外结合能力的检测 | 第125-131页 |
| ·待检测atsRNA的体外转录和标记 | 第127页 |
| ·Hfq蛋白的体外获得 | 第127-130页 |
| ·体外转录标记的atsRNA与Hfq蛋白的体外结合 | 第130-131页 |
| 第二节 结果 | 第131-142页 |
| ·Hfq在atsRNA介导的基因沉默中的作用 | 第131-136页 |
| ·Hfq对atsRNA体内稳定性的影响 | 第136-137页 |
| ·Hfq 与atsRNA 在体外结合能力的检测 | 第137-142页 |
| ·待检测atsRNA 的体外转录和标记 | 第137-139页 |
| ·Hfq蛋白的体外表达及纯化 | 第139-140页 |
| ·Dig标记的atsRNA与Hfq蛋白的体外结合 | 第140-142页 |
| 第三节 讨论 | 第142-143页 |
| 第七章 atsRNA 对靶基因稳定性的影响 | 第143-159页 |
| 第一节 atsRNA 介导的基因沉默对靶mRNA 稳定性的影响 | 第143-151页 |
| ·实验材料和方法 | 第143-147页 |
| ·定量PCR检测atsRNA表达后靶基因EGFP与uidA的mRNA表达水平 | 第144-145页 |
| ·atsRNA的表达对靶基因稳定性的影响 | 第145-147页 |
| ·结果 | 第147-151页 |
| ·定量PCR检测atsRNA表达后靶基因EGFP与uidA的mRNA表达水平 | 第147-150页 |
| ·atsRNA的表达对靶基因稳定性的影响 | 第150-151页 |
| 第二节 atsRNA引起靶mRNA稳定性降低的分子机制 | 第151-156页 |
| ·实验材料和方法 | 第151页 |
| ·atsRNA CY4和CY9在CSH26及HAT03菌株内的干扰活性 | 第151页 |
| ·atsRNA 对靶mRNA 的影响 | 第151页 |
| ·结果 | 第151-156页 |
| 第三节 讨论 | 第156-159页 |
| 第八章 针对细菌必须基因的atsRNA的设计和功能研究 | 第159-168页 |
| 第一节 实验材料和方法 | 第159-160页 |
| ·针对必须基因的atsRNA设计 | 第159页 |
| ·atsRNA表达载体的构建 | 第159页 |
| ·atsRNA功能的鉴定 | 第159-160页 |
| 第二节 结果 | 第160-166页 |
| ·针对必须基因的atsRNA设计 | 第160-163页 |
| ·atsRNA功能的鉴定 | 第163-166页 |
| 第三节 讨论 | 第166-168页 |
| 总结与展望 | 第168-169页 |
| 参考文献 | 第169-180页 |
| 致谢 | 第180-181页 |
| 个人简历 | 第181页 |
| 在学期间发表的学术论文 | 第181页 |
