| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-19页 |
| 1 引言 | 第19-21页 |
| 2 杜氏盐藻(Dunaliella salina)GPI基因ORF的克隆及序列分析 | 第21-38页 |
| ·材料 | 第21-24页 |
| ·主要仪器与设备 | 第21-22页 |
| ·主要试剂 | 第22页 |
| ·常用培养基及液体试剂的配置 | 第22-23页 |
| ·菌株和质粒 | 第23页 |
| ·杜氏盐藻藻株,培养基及培养条件 | 第23-24页 |
| ·引物的设计 | 第24页 |
| ·方法 | 第24-30页 |
| ·杜氏盐藻总RNA的提取 | 第24-25页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第25-26页 |
| ·PCR反应体系及反应条件 | 第26-27页 |
| ·PCR产物的凝胶回收与纯化 | 第27页 |
| ·PCR产物与pMD18-T克隆载体的连接 | 第27-28页 |
| ·重组质粒的转化和蓝白斑筛选阳性克隆试验 | 第28-29页 |
| ·质粒的小量提取和酶切鉴定 | 第29-30页 |
| ·测序和序列分析 | 第30页 |
| ·结果 | 第30-35页 |
| ·杜氏盐藻总RNA的提取 | 第30-31页 |
| ·PCR的扩增结果 | 第31-32页 |
| ·克隆载体的酶切鉴定 | 第32页 |
| ·DNA序列分析 | 第32-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| ·小结 | 第36-38页 |
| 3 DsGPI基因原核表达载体的构建 | 第38-43页 |
| ·材料 | 第38-39页 |
| ·主要仪器设备 | 第38页 |
| ·菌株和载体 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·常用液体配制 | 第39页 |
| ·方法 | 第39-40页 |
| ·DNA目的片段与表达载体的切割 | 第39页 |
| ·目的片断与pET28a(+)表达载体连接 | 第39-40页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第40页 |
| ·转化感受态细胞 | 第40页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第40页 |
| ·结果 | 第40-42页 |
| ·pMD18-DsGPI和pET28a(+)表达载体的限制性酶切 | 第40-41页 |
| ·原核表达载体pET28a-DsGPI的酶切鉴定 | 第41-42页 |
| ·讨论 | 第42页 |
| ·小结 | 第42-43页 |
| 4 pET28a-DsGPI在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达与纯化 | 第43-54页 |
| ·材料 | 第43-45页 |
| ·主要仪器设备 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43页 |
| ·主要试剂的配置方法 | 第43-45页 |
| ·方法 | 第45-49页 |
| ·原核表达载体pET28a-DsGPI转化工程菌BL21(DE3) | 第45页 |
| ·原核表达载体pET28a-DsGPI在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测蛋白表达 | 第45-46页 |
| ·目的蛋白表达的可溶性检测 | 第46-47页 |
| ·重组蛋白诱导表达最佳条件的优化 | 第47页 |
| ·目的蛋白的大量表达 | 第47页 |
| ·包涵体蛋白的洗涤及溶解 | 第47页 |
| ·包涵体蛋白的纯化与定量 | 第47-49页 |
| ·结果 | 第49-52页 |
| ·pET28a-DsGPI转化工程表达菌BL21(DE3) | 第49页 |
| ·pET28a-DsGPI在工程表达菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第49-50页 |
| ·目的蛋白表达的可溶性检测 | 第50-51页 |
| ·重组蛋白质诱导表达最佳条件的优化 | 第51页 |
| ·包涵体蛋白的洗涤溶解与纯化定量 | 第51-52页 |
| ·讨论 | 第52-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 5 兔抗DsGPI多克隆抗体的制备与鉴定 | 第54-63页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·主要仪器设备 | 第54页 |
| ·主要试剂 | 第54页 |
| ·主要试剂的配置方法 | 第54-55页 |
| ·实验动物 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-58页 |
| ·DsGPI融合蛋白抗原的制备 | 第55-56页 |
| ·用DsGPI蛋白抗原对新西兰白兔进行主动免疫 | 第56页 |
| ·多克隆抗体滴度和特异性的检测 | 第56-58页 |
| ·结果 | 第58-61页 |
| ·DsGPI融合蛋白抗原的制备 | 第58页 |
| ·抗原最佳包被浓度的确定 | 第58-59页 |
| ·间接ELISA法检测抗体滴度 | 第59-60页 |
| ·Western blots检测多克隆抗体特异性 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-62页 |
| ·小结 | 第62-63页 |
| 6 在盐胁迫环境下检测杜氏盐藻中DsGPI的表达 | 第63-68页 |
| ·材料 | 第63-64页 |
| ·主要仪器与设备 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| ·杜氏盐藻藻株、培养基和培养条件 | 第63-64页 |
| ·方法 | 第64页 |
| ·杜氏盐藻转入盐胁迫环境下生长 | 第64页 |
| ·杜氏盐藻总蛋白的提取 | 第64页 |
| ·Western blots检测盐胁迫下DsGPI蛋白的表达 | 第64页 |
| ·结果 | 第64-65页 |
| ·杜氏盐藻蛋白的提取 | 第64-65页 |
| ·Western blots检测盐胁迫下DsGPI蛋白的表达 | 第65页 |
| ·讨论 | 第65-67页 |
| ·小结 | 第67-68页 |
| 7 DsGPI与人AMF在MDCK细胞中的定位 | 第68-78页 |
| ·材料 | 第68-70页 |
| ·主要仪器与设备 | 第68页 |
| ·主要试剂 | 第68-69页 |
| ·细胞系、菌株及载体 | 第69页 |
| ·细胞培养所需试剂的配制 | 第69页 |
| ·引物的设计 | 第69-70页 |
| ·方法 | 第70-74页 |
| ·PCR反应体系及反应条件 | 第70页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳及胶回收 | 第70页 |
| ·目的片段和载体的制备 | 第70-71页 |
| ·DH5α感受态细菌的制备 | 第71页 |
| ·转化感受态细菌 | 第71页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第71页 |
| ·测序和序列分析 | 第71-72页 |
| ·无内毒素转染质粒的提取 | 第72-73页 |
| ·荧光表达载体的转染 | 第73页 |
| ·细胞定位 | 第73-74页 |
| ·结果 | 第74-75页 |
| ·PCR扩增DsGPI基因ORF序列 | 第74页 |
| ·重组载体pEGFP-C1-DsGPI的酶切鉴定 | 第74-75页 |
| ·DsGPI的细胞定位 | 第75页 |
| ·讨论 | 第75-77页 |
| ·小结 | 第77-78页 |
| 8 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-83页 |
| 综述 葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)的结构与功能 | 第83-97页 |
| 参考文献 | 第92-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 个人简历 | 第98页 |
| 在学期间发表的学术论文 | 第98页 |
| 在学期间参加的研究项目及学术会议 | 第98页 |
