| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-21页 |
| 前言 | 第21-25页 |
| 技术路线图 | 第25-27页 |
| 第一章 3p21.3区候选抑瘤基因在口腔鳞状细胞癌中的筛选及其甲基化在基因表达中的作用 | 第27-54页 |
| 第一节 材料和方法 | 第27-37页 |
| 1 材料 | 第27-31页 |
| ·细胞和细胞系 | 第27页 |
| ·标本 | 第27-28页 |
| ·引物 | 第28-29页 |
| ·RT-PCR引物 | 第28-29页 |
| ·MSP引物 | 第29页 |
| ·菌株和载体 | 第29-30页 |
| ·菌株 | 第29页 |
| ·载体 | 第29-30页 |
| ·主要试剂/试剂盒 | 第30页 |
| ·主要仪器和设备 | 第30-31页 |
| 2 方法 | 第31-37页 |
| ·组织和细胞总RNA的提取 | 第31-32页 |
| ·RNA的制备 | 第31页 |
| ·RNA中痕量DNA的去除 | 第31页 |
| ·总RNA的鉴定 | 第31-32页 |
| ·两步法差异RT-PCR | 第32-33页 |
| ·逆转录反应 | 第32页 |
| ·PCR反应 | 第32页 |
| ·平台期循环数的确定 | 第32-33页 |
| ·灰度扫描与分析 | 第33页 |
| ·组织和细胞基因组DNA的提取 | 第33页 |
| ·MSPCR | 第33-34页 |
| ·亚硫酸盐处理DNA | 第33-34页 |
| ·MSP | 第34页 |
| ·结果判定及分析 | 第34页 |
| ·PCR产物纯化测序 | 第34-35页 |
| ·甲基化产物测序 | 第35-36页 |
| ·制备感受态 | 第35页 |
| ·连接T载体 | 第35页 |
| ·质粒转化 | 第35-36页 |
| ·测序 | 第36页 |
| ·5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-CdR)处理舌癌细胞系 | 第36页 |
| ·统计学方法 | 第36-37页 |
| 第二节 实验结果 | 第37-46页 |
| 1 生物信息学分析确定待分析基因 | 第37页 |
| 2 RNA质量检测 | 第37-38页 |
| 3 基因扩增平台期的测定 | 第38页 |
| 4 半定量RT-PCR检测候选基因的表达情况 | 第38-40页 |
| 5 四个下调基因在TCA8113细胞和36对OSCC组织中的表达 | 第40-42页 |
| 6 MSP分析基因在OSCC及其癌旁对照组织中甲基化情况 | 第42-46页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第46-54页 |
| 1 染色体3p21.3区候选抑瘤基因在OSCC中的表达 | 第46-51页 |
| 2 启动子区异常甲基化对基因表达的影响 | 第51-54页 |
| 第二章 LTF基因在舌癌中的生物学功能研究 | 第54-78页 |
| 第一节 材料与方法 | 第54-64页 |
| 1 材料 | 第54-57页 |
| ·细胞系 | 第54页 |
| ·标本 | 第54-55页 |
| ·菌株和载体 | 第55-56页 |
| ·引物 | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56-57页 |
| ·主要仪器 | 第57页 |
| 2 方法 | 第57-64页 |
| ·组织和细胞总RNA的提取 | 第57页 |
| ·Real-time quantitative PCR(实时荧光定量PCR) | 第57-58页 |
| ·免疫组化 | 第58页 |
| ·LTF/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建 | 第58-60页 |
| ·质粒酶切、纯化和重组 | 第58-59页 |
| ·质粒转化 | 第59页 |
| ·LTF/pcDNA3.1真核表达载体的鉴定 | 第59-60页 |
| ·细胞转染 | 第60页 |
| ·建立稳定表达LTF基因的TCA8113舌癌细胞系 | 第60页 |
| ·培养细胞的蛋白质制备 | 第60-61页 |
| ·BCA法蛋白定量 | 第61页 |
| ·Western Blotting分析 | 第61页 |
| ·免疫细胞化学 | 第61-62页 |
| ·平板克隆形成实验 | 第62页 |
| ·噻唑蓝(MTT)比色实验检测细胞增殖能力 | 第62-63页 |
| ·流式细胞仪检测细胞周期 | 第63页 |
| ·统计学方法 | 第63-64页 |
| 第二节 实验结果 | 第64-75页 |
| 1 Real-time RT-PCR分析LTF的表达 | 第64页 |
| 2 LTF蛋白在口腔鳞癌组织中的定位表达 | 第64-66页 |
| 3 LTF基因mRNA水平以及蛋白水平表达分析的小结 | 第66页 |
| 4 真核表达载体LTF/pcDNA3.1(-)的构建 | 第66-69页 |
| ·载体构建策略及流程 | 第66-67页 |
| ·pCMV6-XL5-LTF载体的鉴定 | 第67-68页 |
| ·真核表达载体LTF/pcDNA3.1(-)的构建 | 第68-69页 |
| 5 建立稳定表达LTF基因的TCA8113细胞系 | 第69-72页 |
| ·细胞克隆的筛选 | 第69-70页 |
| ·RT-PCR分析稳定转染的细胞克隆中LTF基因mRNA水平的表达 | 第70页 |
| ·PCR鉴定稳定转染细胞中pcDNA3.1(-)载体的整合 | 第70页 |
| ·Western Blotting检测稳定转染后TCA8113细胞中LTF蛋白的表达 | 第70-71页 |
| ·免疫细胞化学检测LTF蛋白的表达及定位 | 第71-72页 |
| 6 稳定转染LTF基因对舌癌细胞TCA8113细胞生物学特性的影响 | 第72-75页 |
| ·LTF基因对细胞增殖能力的影响 | 第72-73页 |
| ·平板克隆形成实验 | 第73-74页 |
| ·LTF基因对细胞周期的影响 | 第74-75页 |
| 第三节 分析与讨论 | 第75-78页 |
| 结论 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-90页 |
| 综述 | 第90-110页 |
| 攻读学位期间主要研究成果(第一作者) | 第110页 |
| 在读期间承担课题(第三责任人) | 第110-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
