| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 1. 前言 | 第12-48页 |
| ·小RNA(Small RNA)概述 | 第12-31页 |
| ·miRNA | 第12-19页 |
| ·miRNA的发现 | 第12-16页 |
| ·miRNA的生物合成 | 第16页 |
| ·miRNA的作用机理 | 第16-18页 |
| ·miRNA的功能 | 第18-19页 |
| ·siRNA (short interfering RNA) | 第19-31页 |
| ·ta-siRNA | 第19-23页 |
| ·Repeat-associated siRNA (ra-siRNA) | 第23-24页 |
| ·nat-siRNA | 第24-25页 |
| ·外源siRNA(short interfering RNA) | 第25-31页 |
| ·植物人工微RNA(artificial microRNA,amiRNA)干扰技术 | 第31-47页 |
| ·植物RNAi技术的种类 | 第33-38页 |
| ·反义RNA技术 | 第33-34页 |
| ·病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS) | 第34-36页 |
| ·发夹RNA干扰(Hairpin RNA Interference,hpRNAi)技术 | 第36-38页 |
| ·amiRNA的特点与设计方法 | 第38-40页 |
| ·amiRNA的特点 | 第38-39页 |
| ·amiRNA的设计方法 | 第39-40页 |
| ·amiRNA基因及其表达载体的构建方法 | 第40-45页 |
| ·amiRNA基因的构建 | 第40-43页 |
| ·amiRNA表达载体的构建方法 | 第43-45页 |
| ·amiRNA干扰技术在植物中的应用 | 第45-47页 |
| ·植物抗病毒研究 | 第45-46页 |
| ·基因功能研究 | 第46-47页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第47-48页 |
| 2. 材料和方法 | 第48-64页 |
| ·材料 | 第48-58页 |
| ·菌株和质粒 | 第48-50页 |
| ·培养基 | 第50-52页 |
| ·主要仪器设备 | 第52页 |
| ·酶和主要试剂 | 第52页 |
| ·主要缓冲液 | 第52-53页 |
| ·引物序列 | 第53-58页 |
| ·方法 | 第58-64页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA | 第58页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第58页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第58-59页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第59页 |
| ·农杆菌的转化 | 第59页 |
| ·无酶克隆方式构建载体 | 第59页 |
| ·DNA的体外操作 | 第59-60页 |
| ·DNA的限制性内切酶的酶切、体外的连接 | 第59-60页 |
| ·T_4 DNA聚合酶处理线性DNA分子 | 第60页 |
| ·MAGIC方法构建植物amiRNA双元表达载体 | 第60页 |
| ·培养基种植拟南芥 | 第60页 |
| ·农杆菌介导的浸花法转化拟南芥 | 第60-61页 |
| ·拟南芥总DNA的提取 | 第61页 |
| ·拟南芥总RNA的提取 | 第61-62页 |
| ·拼接法(splinted ligation)检测amiRNA | 第62-63页 |
| ·实时定量PCR | 第63-64页 |
| 3. 结果与讨论 | 第64-91页 |
| ·基于一步PCR的无酶克隆和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术 | 第64-75页 |
| ·供体质粒pD319a-gfp、pD159a-gfp和pD164a-gfp的构建 | 第64-66页 |
| ·miR319a与miR159a前体中环序列的合成 | 第66页 |
| ·受体质粒p1301-gfp的构建 | 第66页 |
| ·amiRNA双元表达载体的获得 | 第66-69页 |
| ·amiRNA在拟南芥中的表达及干扰效果鉴定 | 第69-71页 |
| ·小结与讨论 | 第71-75页 |
| ·供体载体与受体载体的改造 | 第72页 |
| ·采用无酶克隆方式获得amiRNA表达单元的效率 | 第72-73页 |
| ·通过MAGIC方式获得amiRNA表达载体 | 第73-75页 |
| ·基于lacO重构的蓝白斑筛选和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术 | 第75-82页 |
| ·供体质粒pD319a-gfp(T)的构建 | 第76页 |
| ·amiRNA双元表达载体的获得 | 第76-78页 |
| ·特异性amiRNA在拟南芥中的表达及干扰效果鉴定 | 第78-80页 |
| ·小结与讨论 | 第80-82页 |
| ·基于多引物直接退火的植物amiRNA表达载体构建方法 | 第82-87页 |
| ·表达载体pYH1301-gfp的构建 | 第83-84页 |
| ·水稻amiRNA表达载体的获得 | 第84-85页 |
| ·小结与讨论 | 第85-87页 |
| ·人工ta-siRNAs(artificial ta-siRNAs,ata-siRNAs)对拟南芥内源基因的干扰效果研究 | 第87-91页 |
| 4. 总结与展望 | 第91-93页 |
| ·已取得的主要研究成果 | 第91-92页 |
| ·进一步的研究设想 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-109页 |
| 附录 | 第109-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 发表的相关论文 | 第112页 |
