| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-20页 |
| 1.1 毕赤酵母表达系统 | 第11-14页 |
| 1.1.1 毕赤酵母表达系统的优缺点 | 第11页 |
| 1.1.2 毕赤酵母AOX1启动子改造 | 第11-12页 |
| 1.1.3 毕赤酵母多拷贝菌株筛选 | 第12-13页 |
| 1.1.4 毕赤酵母发酵工艺 | 第13-14页 |
| 1.2 合成生物系统 | 第14-15页 |
| 1.2.1 合成生物学 | 第14页 |
| 1.2.2 CRISRi技术在合成生物学中的应用 | 第14-15页 |
| 1.3 合成生物学在药用产物合成中的应用 | 第15-17页 |
| 1.4 胰岛素及其异源表达 | 第17-18页 |
| 1.4.1 胰岛素 | 第17页 |
| 1.4.2 人胰岛素前体在毕赤酵母中的异源表达 | 第17-18页 |
| 1.5 本课题的研究背景及意义 | 第18-20页 |
| 第2章 毕赤酵母转录信号增益器件的设计与验证 | 第20-44页 |
| 2.1 前言 | 第20页 |
| 2.2 实验材料 | 第20-23页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第20-22页 |
| 2.2.2 培养基和培养条件 | 第22-23页 |
| 2.2.3 主要试剂和仪器 | 第23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-24页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第23-24页 |
| 2.3.2 毕赤酵母感受态细胞的制备及电转化 | 第24页 |
| 2.3.3 毕赤酵母基因组提取与验证 | 第24页 |
| 2.3.4 毕赤酵母eGFP荧光的检测 | 第24页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第24-43页 |
| 2.4.1 基于CRISPR-dCas9的人工转录调控器件的构建与验证 | 第24-37页 |
| 2.4.2 基于乳糖操纵子元件的人工转录调控器件的验证 | 第37-43页 |
| 2.5 小结 | 第43-44页 |
| 第3章 CSAD_5器件的异源蛋白表达分析 | 第44-54页 |
| 3.1 前言 | 第44页 |
| 3.2 实验材料 | 第44-45页 |
| 3.2.1 菌株、质粒和引物 | 第44页 |
| 3.2.2 培养基和培养条件 | 第44-45页 |
| 3.2.3 主要试剂和仪器 | 第45页 |
| 3.3 实验方法 | 第45-46页 |
| 3.3.1 三种异源重组蛋白摇瓶水平发酵 | 第45页 |
| 3.3.2 人胰岛素前体检测 | 第45-46页 |
| 3.3.3 淀粉酶的酶活检测 | 第46页 |
| 3.3.4 人乙肝表面抗原的含量检测 | 第46页 |
| 3.3.5 胞内蛋白的提取 | 第46页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第46-53页 |
| 3.4.1 以CSAD_5驱动异源蛋白表达菌株的质粒构建 | 第46页 |
| 3.4.2 以CSAD_5驱动异源蛋白表达菌株的构建 | 第46-48页 |
| 3.4.3 以P_(AOX1)驱动异源蛋白表达菌株的构建 | 第48页 |
| 3.4.4 人胰岛素前体的表达 | 第48-50页 |
| 3.4.5 淀粉酶的表达 | 第50-51页 |
| 3.4.6 人乙肝表面抗原的表达 | 第51-53页 |
| 3.5 小结 | 第53-54页 |
| 第4章 CSAD_5器件表达人胰岛素前体的反应器发酵 | 第54-61页 |
| 4.1 前言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-56页 |
| 4.3.1 人胰岛素前体菌株种子培养 | 第55页 |
| 4.3.2 人胰岛素前体菌株5L反应器发酵 | 第55页 |
| 4.3.3 人胰岛素前体菌株湿重检测 | 第55页 |
| 4.3.4 人胰岛素前体菌株的发酵工艺 | 第55-56页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第56-60页 |
| 4.4.1 胰岛素前体单拷贝菌株5L反应器葡萄糖发酵工艺探索 | 第56-57页 |
| 4.4.2 胰岛素前体单拷贝菌株5L反应器甲醇发酵工艺分析 | 第57-60页 |
| 4.4.3 葡萄糖工艺与甲醇工艺发酵过程比较 | 第60页 |
| 4.5 小结 | 第60-61页 |
| 第5章 CSAD_5器件表达人胰岛素前体的高产菌株筛选与发酵 | 第61-71页 |
| 5.1 前言 | 第61页 |
| 5.2 实验材料 | 第61-62页 |
| 5.3 实验方法 | 第62页 |
| 5.3.1 高拷贝菌株的筛选 | 第62页 |
| 5.3.2 各菌株拷贝数的比较 | 第62页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第62-70页 |
| 5.4.1 人胰岛素前体基因高拷贝菌株的筛选与验证 | 第62-66页 |
| 5.4.2 CSAD_5-IP基因高拷贝菌株的筛选与验证 | 第66-70页 |
| 5.5 小结 | 第70-71页 |
| 第6章 结论与展望 | 第71-73页 |
| 6.1 结论 | 第71-72页 |
| 6.2 创新点 | 第72页 |
| 6.3 展望 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 攻读硕士学位期间撰写的论文 | 第80-81页 |
| 附录1 实验中所用的菌株 | 第81-84页 |
| 附录2 实验中所用的质粒 | 第84-85页 |
