| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第1章 综述 | 第14-37页 |
| 1.1 衣康酸概述 | 第14-18页 |
| 1.1.1 衣康酸的理化性质及用途 | 第14页 |
| 1.1.2 衣康酸的生产方法 | 第14-18页 |
| 1.1.2.1 衣康酸的生物合成机理研究 | 第15页 |
| 1.1.2.2 化学合成法 | 第15-16页 |
| 1.1.2.3 生物发酵法 | 第16-18页 |
| 1.2 多酶组装 | 第18-29页 |
| 1.2.1 胞内多酶级联反应概述 | 第19-20页 |
| 1.2.2 多酶组装 | 第20-21页 |
| 1.2.3 多酶组装策略的研究进展 | 第21-29页 |
| 1.2.3.1 直接蛋白融合组装 | 第21-22页 |
| 1.2.3.2 多酶共固定 | 第22-25页 |
| 1.2.3.3 二维或三维支架介导的组装 | 第25-28页 |
| 1.2.3.4 基于细胞器改造的多酶定位 | 第28-29页 |
| 1.3 大肠杆菌代谢途径改造 | 第29-34页 |
| 1.3.1 代谢工程概述 | 第29-30页 |
| 1.3.2 基因编辑策略 | 第30-32页 |
| 1.3.2.1 基因重组技术 | 第31页 |
| 1.3.2.2 序列特异性核酸酶编辑技术 | 第31-32页 |
| 1.3.3 基于CRISPR-Cas9技术的代谢途径改造 | 第32-34页 |
| 1.4 课题的研究背景与意义 | 第34-35页 |
| 1.5 课题的主要内容 | 第35-37页 |
| 第2章 大肠杆菌胞内双酶自组装体系的建立 | 第37-64页 |
| 2.1 引言 | 第37-38页 |
| 2.2 实验材料 | 第38-41页 |
| 2.2.1 主要试剂 | 第38页 |
| 2.2.2 主要仪器设备 | 第38-39页 |
| 2.2.3 培养基及溶液的配制 | 第39-40页 |
| 2.2.4 菌株与质粒 | 第40页 |
| 2.2.5 引物 | 第40-41页 |
| 2.2.6 主要应用软件、网站 | 第41页 |
| 2.3 实验方法 | 第41-53页 |
| 2.3.1 土曲霉中乌头酸脱羧酶基因cadA的获取 | 第41-45页 |
| 2.3.2 CAD和ACN相关蛋白的克隆与表达 | 第45-50页 |
| 2.3.3 蛋白浓缩与酶活检测 | 第50-51页 |
| 2.3.4 底物抑制研究 | 第51页 |
| 2.3.5 蛋白分子量分析 | 第51-52页 |
| 2.3.6 胞外双酶自组装体表征 | 第52页 |
| 2.3.7 双酶自组装菌株构建及其催化效率分析 | 第52-53页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第53-62页 |
| 2.4.1 获取乌头酸酶(ACN)和乌头酸脱羧酶(CAD)基因 | 第53页 |
| 2.4.2 胞内异源双酶组装实验思路 | 第53-54页 |
| 2.4.3 乌头酸酶ACN与乌头酸脱羧酶CAD的表达,纯化及酶活分析 | 第54-56页 |
| 2.4.4 蛋白酶的分子量鉴定 | 第56-58页 |
| 2.4.5 动态光散射(DLS)表征胞外自组装过程 | 第58-59页 |
| 2.4.6 pH、温度对自组装菌催化性质的影响 | 第59-60页 |
| 2.4.7 双酶自组装产衣康酸菌株性能表征 | 第60-61页 |
| 2.4.8 产物抑制研究 | 第61-62页 |
| 2.5 本章小结 | 第62-64页 |
| 第3章 大肠杆菌胞内三酶自组装体系的建立 | 第64-85页 |
| 3.1 引言 | 第64-65页 |
| 3.2 实验材料 | 第65-68页 |
| 3.2.1 主要材料与试剂 | 第65页 |
| 3.2.2 主要仪器设备 | 第65-66页 |
| 3.2.3 菌株与质粒 | 第66页 |
| 3.2.4 引物 | 第66-68页 |
| 3.2.5 主要应用软件、网站 | 第68页 |
| 3.3 实验方法 | 第68-73页 |
| 3.3.1 柠檬酸合酶gltA、乌头酸酶acnA和乌头酸脱羧酶cadA基因的获取 | 第68页 |
| 3.3.2 三酶线性随机自组装相关质粒构建 | 第68-70页 |
| 3.3.3 顺序自组装相关质粒构建 | 第70页 |
| 3.3.4 顺序自组装模式筛选 | 第70-71页 |
| 3.3.5 蛋白表达、纯化及SDS-PAGE检测 | 第71页 |
| 3.3.6 酶活检测 | 第71页 |
| 3.3.7 胞外多酶组装体的构建及理化性质分析 | 第71-72页 |
| 3.3.8 三分子荧光互补(TFFC)实验的质粒构建与共表达 | 第72页 |
| 3.3.9 荧光分析 | 第72-73页 |
| 3.3.10 摇瓶培养基优化 | 第73页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第73-83页 |
| 3.4.1 三酶线性随机自组装实验思路 | 第73-74页 |
| 3.4.2 顺序自组装实验思路及最优选择 | 第74-76页 |
| 3.4.3 柠檬酸合酶GA、乌头酸酶ACN与乌头酸脱羧酶CAD的表达,纯化及酶活检测 | 第76-77页 |
| 3.4.4 动态光散射(DLS)分析胞外自组装过程 | 第77-78页 |
| 3.4.5 SEM、FE-SEM及AFM表征胞外自组装体 | 第78-79页 |
| 3.4.6 TFFC验证胞内自组装 | 第79-81页 |
| 3.4.7 胞内三酶线性随机自组装菌和多酶反应器自组装菌的催化能力 | 第81-83页 |
| 3.5 本章小结 | 第83-85页 |
| 第4章 基于CRISPR-Cas9技术改造大肠杆菌代谢途径及高产衣康酸菌株的构建 | 第85-102页 |
| 4.1 引言 | 第85-86页 |
| 4.2 实验材料 | 第86-89页 |
| 4.2.1 主要材料与试剂 | 第86页 |
| 4.2.2 主要仪器设备 | 第86页 |
| 4.2.3 菌株与质粒 | 第86-87页 |
| 4.2.4 引物 | 第87-89页 |
| 4.2.5 主要应用软件、网站 | 第89页 |
| 4.3 实验方法 | 第89-94页 |
| 4.3.1 CRISPR-Cas9基因组编辑工具pCas和pTarget质粒的获取 | 第90页 |
| 4.3.2 目的基因的定位与靶向序列N20+PAM的确定 | 第90-91页 |
| 4.3.3 敲除基因上下游序列 | 第91页 |
| 4.3.4 敲除质粒的构建 | 第91-92页 |
| 4.3.5 大肠杆菌电转感受态的制备 | 第92页 |
| 4.3.6 CRISPR-Cas9基因编辑及质粒消除 | 第92-93页 |
| 4.3.7 基因敲除菌感受态制备与转化 | 第93页 |
| 4.3.8 组装敲除菌摇瓶发酵培养基优化 | 第93-94页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第94-100页 |
| 4.4.1 CRISPR-Cas技术敲除基因结果分析 | 第94-95页 |
| 4.4.2 敲除乙醛酸途径基因aceA对衣康酸产量的影响 | 第95-96页 |
| 4.4.3 敲除TCA循环中异柠檬酸下游途径基因对菌株表型及衣康酸产量的影响 | 第96-97页 |
| 4.4.4 敲除葡萄糖磷酸转移酶系统和副产物代谢途径相关酶对衣康酸产量的影响 | 第97-99页 |
| 4.4.5 最优化敲除自组装菌中副产物积累与分析 | 第99-100页 |
| 4.5 本章小结 | 第100-102页 |
| 第5章 结论与展望 | 第102-105页 |
| 参考文献 | 第105-119页 |
| 附件 | 第119-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 攻读博士学棚间取得的成果 | 第125页 |
