| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-11页 |
| Abstract | 第11-14页 |
| 1 研究背景 | 第20-53页 |
| 1.1 双生病毒的发生和危害 | 第20-21页 |
| 1.2 双生病毒的分类和基因组结构 | 第21-26页 |
| 1.3 双生病毒的侵染 | 第26-35页 |
| 1.3.1 双生病毒复制的细胞环境 | 第26-27页 |
| 1.3.2 双生病毒复制相关结构域 | 第27-28页 |
| 1.3.3 双生病毒的复制循环 | 第28-31页 |
| 1.3.3.1 互补链的复制 | 第30-31页 |
| 1.3.3.2 病毒链的复制 | 第31页 |
| 1.3.4 双生病毒编码的Rep蛋白的结构和功能 | 第31-33页 |
| 1.3.5 与Rep互作的病毒蛋白及寄主因子 | 第33-35页 |
| 1.4 Begomoviruses的传播及在介体中的增殖复制 | 第35-36页 |
| 1.5 双生病毒的致病机理 | 第36-38页 |
| 1.6 模式寄主酵母在双生病毒复制研究中的运用 | 第38-39页 |
| 1.7 单组份begomovirus伴随的betasatellite | 第39-46页 |
| 1.7.1 Betasatellite的基因组结构 | 第39-41页 |
| 1.7.2 Betasatellite参与病害症状的形成 | 第41-42页 |
| 1.7.3 Betasatellite抑制转录后水平基因沉默(PTGS) | 第42-43页 |
| 1.7.4 Betasatellite抑制转录水平基因沉默(TGS) | 第43-44页 |
| 1.7.5 Betasatellite参与双生病毒的运动 | 第44-45页 |
| 1.7.6 Betasatellite参与对寄主防卫反应的抑制 | 第45-46页 |
| 1.8 Betasatellites的复制 | 第46-48页 |
| 1.9 Betasatellites的起源和进化 | 第48-50页 |
| 1.10 基于指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment, SELEX) | 第50-51页 |
| 1.11 本项目的研究目的和意义 | 第51-53页 |
| 2 实验方法 | 第53-91页 |
| 2.1 常规DNA克隆技术 | 第53-68页 |
| 2.1.1 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术 | 第53-58页 |
| 2.1.2 PCR产物的纯化 | 第58-60页 |
| 2.1.3 质粒载体的去磷酸化 | 第60-61页 |
| 2.1.4 载体连接 | 第61-64页 |
| 2.1.5 感受态细胞的制备 | 第64-65页 |
| 2.1.6 大肠杆菌的转化 | 第65-66页 |
| 2.1.7 菌落PCR筛选鉴定 | 第66页 |
| 2.1.8 大肠杆菌质粒提取 | 第66-68页 |
| 2.1.9 重组质粒的酶切验证 | 第68页 |
| 2.1.10 重组质粒的测序分析 | 第68页 |
| 2.2 根癌农杆菌转化及农杆菌介导的植物接种 | 第68-70页 |
| 2.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备 | 第68-69页 |
| 2.2.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌 | 第69页 |
| 2.2.3 根癌农杆菌的浸润接种 | 第69-70页 |
| 2.3 植物总DNA提取及Southern blot分析 | 第70-78页 |
| 2.3.1 植物总DNA大量抽提 | 第70-72页 |
| 2.3.2 植物总DNA小量抽提 | 第72-73页 |
| 2.3.3 植物总DNA小量抽提(试剂盒法) | 第73-74页 |
| 2.3.4 Southern blot杂交分析 | 第74-78页 |
| 2.4 植物总RNA提取及荧光定量PCR | 第78-81页 |
| 2.4.1 植物总RNA小量提取 | 第78-80页 |
| 2.4.2 反转录RT-PCR和RT-qPCR | 第80-81页 |
| 2.5 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE电泳及Western blot印记分析 | 第81-85页 |
| 2.5.1 植物总蛋白的提取 | 第81-82页 |
| 2.5.2 蛋白的SDS-PAGE电泳及Western blot印记分析 | 第82-85页 |
| 2.6 蛋白的原核表达及纯化 | 第85-87页 |
| 2.6.1 常用的原核表达系统 | 第85页 |
| 2.6.2 融合蛋白的原核表达 | 第85-86页 |
| 2.6.3 原核表达蛋白的纯化 | 第86-87页 |
| 2.7 凝胶阻滞试验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay) | 第87-88页 |
| 2.8 指数富集的配体系统进化技术(SELEX) | 第88-91页 |
| 3 Begomoviruses伴随的betasatellite复制相关顺式作用元件的鉴定及复制机理研究 | 第91-158页 |
| 3.1 实验材料与方法 | 第92-104页 |
| 3.1.1 植物材料 | 第92页 |
| 3.1.2 病毒材料 | 第92页 |
| 3.1.3 DNAβ RBM相关突变体侵染性克隆的构建 | 第92-97页 |
| 3.1.4 农杆菌介导的植物接种 | 第97页 |
| 3.1.5 接种植株中病毒的检测 | 第97页 |
| 3.1.6 Y10Rep和Y35Rep的原核表达 | 第97-98页 |
| 3.1.7 Y10Rep和Y35Rep的纯化 | 第98-99页 |
| 3.1.8 凝胶阻滞试验(EMSA) | 第99-102页 |
| 3.1.9 叶盘复制试验 | 第102-103页 |
| 3.1.10 指数富集的配体系统进化技术(SELEX) | 第103-104页 |
| 3.2 结果与分析 | 第104-153页 |
| 3.2.1 卫星DNAβ中的RBM序列决定了DNAβ的复制效率及专化性 | 第104-107页 |
| 3.2.2 卫星DNAβRBM中的iterons序列影响了DNAβ的复制与侵染 | 第107-112页 |
| 3.2.3 RBM中的iterons序列决定了DNAβ被辅助病毒复制的选择性 | 第112-116页 |
| 3.2.4 RBM中iterons决定了DNAβ与辅助病毒Rep亲和结合的特异性和强度 | 第116-124页 |
| 3.2.5 Iterons决定Rep-RBM结合的强度和特异性在双生病毒中普遍存在 | 第124-127页 |
| 3.2.6 TbCSB RBM中iterons碱基序列的排列及偏好性 | 第127-131页 |
| 3.2.7 SELEX体外研究DNAβ的遗传进化 | 第131-138页 |
| 3.2.8 Y35β RBM中复制核心元件的鉴定 | 第138-146页 |
| 3.2.9 DNAβ与辅助病毒iterons的关系 | 第146-148页 |
| 3.2.10 TbCSV-Y35 iterons序列是病毒复制必需的顺式元件 | 第148-153页 |
| 3.3 讨论 | 第153-158页 |
| 4 与begomovirus复制起始蛋白Rep互作的本氏烟寄主因子筛选和功能研究 | 第158-185页 |
| 4.1 实验材料和方法 | 第158-166页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第158-159页 |
| 4.1.2 实验方法 | 第159-166页 |
| 4.1.2.1 酵母双杂交筛库诱饵质粒的构建 | 第159-162页 |
| 4.1.2.2 酵母转化(LiAc法) | 第162-163页 |
| 4.1.2.3 MYMIV-AC1、Y10AC1、Y35AC1对酵母细胞毒性及自激活活性检测 | 第163页 |
| 4.1.2.4 共转化法进行酵母双杂交筛库 | 第163-165页 |
| 4.1.2.5 酵母双杂交回转验证候选互作蛋白 | 第165-166页 |
| 4.2 实验结果与分析 | 第166-182页 |
| 4.2.1 诱饵蛋白MYMIV-AC1、Y10AC1、Y35AC1对酵母毒性及自激活检测 | 第166-167页 |
| 4.2.2 与Y10AC1、Y35AC1、MYMIV-AC1互作的本氏烟寄主因子筛选 | 第167-169页 |
| 4.2.3 TRV沉默分析部分本氏烟寄主因子对TbCSV复制的影响 | 第169-171页 |
| 4.2.4 酵母双杂交验证Ferredoxin Ⅰ与诱饵蛋白的互作 | 第171-173页 |
| 4.2.5 BiFC验证NbFdnI与Y35AC1的互作 | 第173-175页 |
| 4.2.6 GST pull-down验证NbFdnI与Y35AC1之间的互作 | 第175-176页 |
| 4.2.7 NbFdnI的亚细胞定位及对双生病毒侵染的响应 | 第176-180页 |
| 4.2.8 NbFdnI对TbCSV-Y35病毒侵染的影响 | 第180-182页 |
| 4.3 讨论 | 第182-185页 |
| 5 印度绿豆黄化花叶病毒复制相关酵母寄主因子鉴定及编码的AC5基因功能研究 | 第185-227页 |
| 5.1 实验材料和方法 | 第186-194页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第186-187页 |
| 5.1.2 载体构建 | 第187-192页 |
| 5.1.3 温度敏感型酵母突变体转化 | 第192-193页 |
| 5.1.4 温度敏感型酵母突变体库筛选理论依据 | 第193-194页 |
| 5.2 结果与分析 | 第194-225页 |
| 5.2.1 MYMIV DNA-A能在酵母中复制 | 第194-196页 |
| 5.2.2 影响MYMIV复制的酵母寄主因子筛选 | 第196-209页 |
| 5.2.3 MYMIV在酵母中复制模式的研究 | 第209-214页 |
| 5.2.4 MYMIV编码的AC5基因功能分析 | 第214-225页 |
| 5.2.4.1 AC5基因对MYMIV在酵母中复制的影响 | 第214-215页 |
| 5.2.4.2 AC5基因对MYMIV在植物寄主中复制侵染的影响 | 第215-218页 |
| 5.2.4.3 转基因表达AC5回补MYMIV-AC5m的侵染缺陷 | 第218-219页 |
| 5.2.4.4 MYMIV编码的AC5是一个症状决定因子 | 第219-222页 |
| 5.2.4.5 AC5基因能抑制寄主的RNA沉默反应 | 第222-225页 |
| 5.3 讨论 | 第225-227页 |
| 6 全文小结 | 第227-229页 |
| 参考文献 | 第229-251页 |
| 附录A 本论文中所用缩写词及中英文对照 | 第251-255页 |
| 附录B 本论文所用病毒缩写及中英文对照 | 第255-259页 |
| 附录C 常用缓冲液及培养基配方 | 第259-270页 |
| 作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第270页 |
