| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 目录 | 第14-18页 |
| 符号说明 | 第18-19页 |
| 1 前言 | 第19-22页 |
| 2 正常胆囊上皮细胞及胆囊癌细胞miRNA差异表达谱的建立 | 第22-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-26页 |
| 2.1.1 正常胆囊上皮细胞 | 第22页 |
| 2.1.2 胆囊癌细胞株 | 第22页 |
| 2.1.3 胆囊癌组织 | 第22-23页 |
| 2.1.4 主要试剂及耗材 | 第23-24页 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 | 第24-25页 |
| 2.1.6 主要试剂的配置方法 | 第25-26页 |
| 2.2 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.2.1 细胞培养 | 第26-27页 |
| 2.2.2 细胞RNA提取 | 第27页 |
| 2.2.3 RNA质量鉴定 | 第27页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 | 第27页 |
| 2.2.5 芯片制备 | 第27-28页 |
| 2.2.6 对样品RNA进行荧光标记 | 第28-29页 |
| 2.2.7 杂交与清洗 | 第29-30页 |
| 2.2.8 芯片图像的采集与数据分析 | 第30页 |
| 2.2.9 Real-time PCR验证miRNA-145在胆囊腺癌组织及正常胆囊组织中的表达 | 第30-31页 |
| 2.2.10 统计学分析 | 第31页 |
| 2.3 结果 | 第31-36页 |
| 2.3.1 细胞总RNA质检结果 | 第31-32页 |
| 2.3.2 miRNA芯片结果 | 第32-33页 |
| 2.3.3 Real-time PCR检测临床胆囊癌组织miRNA-145表达 | 第33-36页 |
| 2.4 讨论 | 第36-39页 |
| 2.5 小结 | 第39-40页 |
| 3 hsa-miRNA-145在胆囊癌细胞系GBC-SD中的生物学功能 | 第40-67页 |
| 3.1 实验材料 | 第40-44页 |
| 3.1.1 软件与数据库网站 | 第40-41页 |
| 3.1.2 细胞 | 第41页 |
| 3.1.3 菌株和质粒 | 第41页 |
| 3.1.4 PCR引物 | 第41页 |
| 3.1.5 主要试剂 | 第41页 |
| 3.1.6 主要仪器和设备 | 第41-42页 |
| 3.1.7 溶液配制 | 第42-44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-55页 |
| 3.2.1 miR-hsa-miRNA-145表达载体的构建策略 | 第44-50页 |
| 3.2.2 细胞培养 | 第50-51页 |
| 3.2.3 表达质粒的瞬时转染 | 第51页 |
| 3.2.4 细胞稳定转染及克隆筛选 | 第51页 |
| 3.2.5 MTT法检测细胞增殖 | 第51-52页 |
| 3.2.6 流式实验检测细胞周期 | 第52页 |
| 3.2.7 蛋白质印迹(Western blot) | 第52-54页 |
| 3.2.8 Transwell测细胞侵袭能力 | 第54页 |
| 3.2.9 克隆形成实验 | 第54-55页 |
| 3.2.10 流式细胞仪实验检测细胞凋亡 | 第55页 |
| 3.2.11 统计学分析软件及方法同第一章 | 第55页 |
| 3.3 结果 | 第55-62页 |
| 3.3.1 成功构建hsa-miRNA-145过表达载体 | 第55-57页 |
| 3.3.2 成功构建hsa-miRNA-145过表达胆囊癌稳定细胞系 | 第57-58页 |
| 3.3.3 稳定转染hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞系表现出生长抑制的现象 | 第58页 |
| 3.3.4 过表达hsa-miRNA-145对细胞周期无显著影响 | 第58-59页 |
| 3.3.5 hsa-miRNA-145诱导GBC-SD细胞凋亡 | 第59-61页 |
| 3.3.6 hsa-miRNA-145抑制GBC-SD细胞的克隆形成能力 | 第61页 |
| 3.3.7 过表达hsa-miRNA-145导致GBC-SD细胞迁移能力下降 | 第61-62页 |
| 3.4 讨论 | 第62-65页 |
| 3.4.1 hsa-miRNA-145在多种肿瘤病理发生中的作用 | 第62-63页 |
| 3.4.2 hsa-miRNA-145不能抑制胆囊癌细胞的增殖 | 第63-64页 |
| 3.4.3 hsa-miRNA-145通过影响胆囊癌细胞的凋亡来控制肿瘤的生长 | 第64-65页 |
| 3.4.4 hsa-miRNA-145影响胆囊癌细胞的克隆形成 | 第65页 |
| 3.4.5 hsa-miRNA-145有可能通过影响迁移调控胆囊癌的发展 | 第65页 |
| 3.5 小结 | 第65-67页 |
| 4 miRNA-145在调节胆囊癌细胞系功能中的靶基因探究 | 第67-82页 |
| 4.1 实验材料 | 第68-69页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第68页 |
| 4.1.2 PCR引物 | 第68页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第68页 |
| 4.1.4 主要试剂、仪器和设备 | 第68-69页 |
| 4.2 实验方法 | 第69-73页 |
| 4.2.1 细胞培养、总RNA提取、凝胶电泳及Real-time PCR | 第69页 |
| 4.2.2 DNA提取方法同第二章 | 第69页 |
| 4.2.3 PCR获取DFF45目的片段 | 第69页 |
| 4.2.4 DFF45目的片段双酶切与回收 | 第69-70页 |
| 4.2.5 双酶切pGL3.7真核表达载体 | 第70页 |
| 4.2.6 DFF-45 CDS854片段与载体连接 | 第70页 |
| 4.2.7 DFF-45 CDS854重组载体的鉴定 | 第70-71页 |
| 4.2.8 DFF-45 CDS854突变载体构建 | 第71-73页 |
| 4.2.9 双荧光素酶报告系统检测分析 | 第73页 |
| 4.3 结果 | 第73-79页 |
| 4.3.1 过表达miRNA-145下调DFF45 mRNA表达水平 | 第73-74页 |
| 4.3.2 过表达miRNA-145下调DFF45蛋白表达水平 | 第74-75页 |
| 4.3.3 miRNA-145与DFF45野生型、突变型结合位点荧光报告载体的构建 | 第75-78页 |
| 4.3.4 miRNA-145通过调节DFF45 mRNACDS854的活性影响DFF45的表达水平 | 第78-79页 |
| 4.4 讨论 | 第79-81页 |
| 4.4.1 DFF45对凋亡的作用机理及其与肿瘤发生的关系 | 第79-80页 |
| 4.4.2 miRNA-145可能通过靶向DFF45特异性调节胆囊癌细胞的凋亡 | 第80-81页 |
| 4.5 小结 | 第81-82页 |
| 5 胆囊腺癌组织中DFF45表达及临床病理意义 | 第82-92页 |
| 5.1 实验材料 | 第82-84页 |
| 5.1.1 临床资料 | 第82-83页 |
| 5.1.2 主要试剂及耗材 | 第83页 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 | 第83-84页 |
| 5.2 实验方法 | 第84-85页 |
| 5.2.1 EnVision两步法 | 第84页 |
| 5.2.2 统计学分析 | 第84-85页 |
| 5.3 结果 | 第85-88页 |
| 5.3.1 DFF45在胆囊良恶性病变中表达情况 | 第85页 |
| 5.3.2 DFF45表达与胆囊腺癌临床病理特征的关系 | 第85-86页 |
| 5.3.3 DFF45表达与胆囊腺癌患者生存期的关系 | 第86-88页 |
| 5.4 讨论 | 第88-91页 |
| 5.4.1 DFF45在人类胆囊癌组织中表达上调 | 第88-89页 |
| 5.4.2 DFF45表达上调表现为预后较好 | 第89-90页 |
| 5.4.3 hsa-miRNA-145靶向DFF45调控胆囊癌细胞凋亡的临床意义与展望 | 第90-91页 |
| 5.5 小结 | 第91-92页 |
| 6 结论 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-103页 |
| 综述 | 第103-123页 |
| 参考文献 | 第113-123页 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 | 第123-124页 |
| 致谢 | 第124页 |
