| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 前言 | 第14-24页 |
| 1.1 恶性肿瘤的特点 | 第14-15页 |
| 1.2 肺癌 | 第15-16页 |
| 1.3 Copines蛋白家族 | 第16-17页 |
| 1.4 Copine-3蛋白 | 第17-18页 |
| 1.5 RNA干扰技术及其应用 | 第18-19页 |
| 1.6 慢病毒及其应用 | 第19-20页 |
| 1.7 蛋白质组学技术及其应用 | 第20-22页 |
| 1.8 本课题的研究意义 | 第22-23页 |
| 1.9 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 Copine-3蛋白在肺腺癌细胞和肿瘤组织中的表达检测 | 第24-37页 |
| 2.1 材料 | 第24页 |
| 2.1.1 细胞和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-29页 |
| 2.2.1 细胞的复苏 | 第24-25页 |
| 2.2.2 细胞传代 | 第25页 |
| 2.2.3 细胞的冻存 | 第25页 |
| 2.2.4 细胞总蛋白的抽提 | 第25页 |
| 2.2.5 Western-blot免疫印记 | 第25-26页 |
| 2.2.6 质粒转染细胞 | 第26页 |
| 2.2.7 蛋白质的亚细胞定位 | 第26-27页 |
| 2.2.8 细胞的亚细胞组份分离 | 第27-28页 |
| 2.2.9 免疫组化 | 第28-29页 |
| 2.3 结果 | 第29-35页 |
| 2.3.1 Copine-3蛋白在各肺腺癌细胞中的表达 | 第29-30页 |
| 2.3.2 Copine-3蛋白在肺腺癌组织中的表达 | 第30页 |
| 2.3.3 肺腺癌细胞胞浆与胞核蛋白的分离 | 第30-32页 |
| 2.3.4 Copine-3蛋白在细胞中的定位 | 第32-35页 |
| 2.4 讨论 | 第35-36页 |
| 2.5 小结 | 第36-37页 |
| 第三章 SILAC技术解析瞬时干扰CPNE3基因促进A549细胞迁移 | 第37-52页 |
| 3.1 材料 | 第37-38页 |
| 3.1.1 siRNA片段 | 第37页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第37-38页 |
| 3.2 方法 | 第38-43页 |
| 3.2.1 细胞毒性检测 | 第38页 |
| 3.2.2 siRNA片段转染细胞 | 第38-39页 |
| 3.2.3 Transwell实验检测细胞迁移 | 第39页 |
| 3.2.4 稳定同位素标记细胞 | 第39-40页 |
| 3.2.5 聚丙烯酰胺凝胶的银染 | 第40页 |
| 3.2.6 蛋白质的胶内酶解 | 第40-42页 |
| 3.2.7 质谱鉴定 | 第42页 |
| 3.2.8 生物信息学分析 | 第42-43页 |
| 3.3 结果 | 第43-50页 |
| 3.3.1 脂质体法转染对细胞的毒性检测 | 第43页 |
| 3.3.2 具有沉默CPNE3基因效果的siRNA片段筛选 | 第43-44页 |
| 3.3.3 siRNA介导CPNE3基因沉默促进A549细胞迁移 | 第44页 |
| 3.3.4 SILAC标记siRNA介导CPNE3基因沉默的A549细胞 | 第44-45页 |
| 3.3.5 总蛋白样品中差异蛋白的检测 | 第45-46页 |
| 3.3.6 差异蛋白质组学数据分析 | 第46-48页 |
| 3.3.7 SQSTM1/p62蛋白调控EMT途径的验证 | 第48-50页 |
| 3.4 讨论 | 第50-51页 |
| 3.5 小结 | 第51-52页 |
| 第四章 SILAC技术解析稳定沉默CPNE3基因促进细胞增殖 | 第52-73页 |
| 4.1 材料 | 第52页 |
| 4.1.1 慢病毒 | 第52页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第52页 |
| 4.2 方法 | 第52-54页 |
| 4.2.1 慢病毒侵染细胞 | 第52-53页 |
| 4.2.2 平板克隆形成实验 | 第53页 |
| 4.2.3 软琼脂克隆形成实验 | 第53-54页 |
| 4.2.4 WST-8法检测细胞增殖 | 第54页 |
| 4.3 结果 | 第54-71页 |
| 4.3.1 CPNE3基因稳定沉默细胞株的构建 | 第54-56页 |
| 4.3.2 CPNE3基因稳定沉默检测 | 第56-57页 |
| 4.3.3 CPNE3基因稳定沉默促进细胞增殖 | 第57-60页 |
| 4.3.4 CPNE3基因过表达HBE细胞株的构建 | 第60-61页 |
| 4.3.5 CPNE3基因过表达抑制HBE细胞增殖 | 第61-63页 |
| 4.3.6 CPNE3基因稳定沉默对细胞迁移能力无影响 | 第63-64页 |
| 4.3.7 SILAC标记CPNE3基因稳定沉默的A549细胞 | 第64页 |
| 4.3.8 总蛋白样品中差异蛋白的检测 | 第64-65页 |
| 4.3.9 核蛋白样品中差异蛋白的检测 | 第65-66页 |
| 4.3.10 总蛋白的差异蛋白组学数据分析 | 第66-69页 |
| 4.3.11 核蛋白的差异蛋白组质学数据分析 | 第69-71页 |
| 4.4 讨论 | 第71-72页 |
| 4.5 小结 | 第72-73页 |
| 第五章 总结与展望 | 第73-75页 |
| 5.1 总结 | 第73页 |
| 5.2 展望 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-83页 |
| 附录一 瞬时干扰CPNE3基因A549细胞总蛋白中的差异蛋白 | 第83-85页 |
| 附录二 稳定沉默CPNE3基因A549细胞总蛋白中的差异蛋白 | 第85-89页 |
| 附录三 稳定沉默CPNE3基因A549细胞核蛋白中的差异蛋白 | 第89-102页 |
| 附录四 所用主要仪器设备 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第104页 |
