| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 前言 | 第15-17页 |
| 第一章 miRNA调控脂肪细胞分化 | 第17-31页 |
| 1.1 miRNA的生物学起源及其生物学特性 | 第17-19页 |
| 1.2 脂肪细胞的起源 | 第19页 |
| 1.3 脂肪细胞分化的过程 | 第19-21页 |
| 1.3.1 定向 | 第19-20页 |
| 1.3.2 生长停滞和有丝分裂克隆扩增 | 第20页 |
| 1.3.3 终端分化 | 第20-21页 |
| 1.4 脂肪细胞形成的转录级联调控 | 第21-22页 |
| 1.5 miRNAs通过作用于转录因子调控脂肪细胞分化 | 第22-24页 |
| 1.5.1 PPARs | 第22-24页 |
| 1.5.2 C/EBPs | 第24页 |
| 1.6 miRNAs通过影响信号通路调控脂肪细胞分化 | 第24-30页 |
| 1.6.1 MAPK信号通路 | 第24-26页 |
| 1.6.2 PI3K/Akt信号通路 | 第26-27页 |
| 1.6.3 cAMP/PKA/CREB信号通路 | 第27-28页 |
| 1.6.4 Wnt/β-catenin信号通路 | 第28-29页 |
| 1.6.5 TGF-β信号通路 | 第29-30页 |
| 1.7 miRNAs通过抑制有丝分裂克隆扩增阶段而抑制脂肪分化 | 第30页 |
| 1.8 结论 | 第30-31页 |
| 第二章 候选miR-191的研究进展 | 第31-37页 |
| 2.1 Solexa测序数据分析 | 第31-32页 |
| 2.2 miR-191的生物学信息及其概述 | 第32-33页 |
| 2.3 miR-191的保守性 | 第33-34页 |
| 2.4 miR-191的生物学功能 | 第34-36页 |
| 2.4.1 miR-191在癌症细胞中的作用研究 | 第34-35页 |
| 2.4.2 miR-191参与糖尿病 | 第35页 |
| 2.4.3 miR-191可能参与脂肪细胞分化的预测 | 第35-36页 |
| 2.5 小结 | 第36-37页 |
| 第三章 实验假设与实验目标 | 第37-39页 |
| 3.1 基于文献综述发现的科学问题 | 第37页 |
| 3.2 实验的假设 | 第37-38页 |
| 3.3 实验的目标 | 第38-39页 |
| 第四章 MiR-191在猪脂肪细胞形成中的表达规律 | 第39-47页 |
| 4.1 引言 | 第39页 |
| 4.2 实验材料与方法 | 第39-40页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第39-40页 |
| 4.2.2 实验方法 | 第40页 |
| 4.3 结果 | 第40-44页 |
| 4.3.1 Solexa测序分析miR-191的表达 | 第40-41页 |
| 4.3.2 猪不同组织中miR-191的表达分布 | 第41-42页 |
| 4.3.3 建立猪前体脂肪细胞的分化模型 | 第42-43页 |
| 4.3.4 猪前体脂肪细胞分化过程中miR-191的表达 | 第43-44页 |
| 4.4 讨论 | 第44-45页 |
| 4.4.1 Solexa测序的应用 | 第44页 |
| 4.4.2 脂肪组织发育上调miR-191 | 第44页 |
| 4.4.3 脂肪细胞形成的离体模型 | 第44-45页 |
| 4.4.4 脂肪细胞分化上调miR-191 | 第45页 |
| 4.5 小结 | 第45-47页 |
| 第五章 MiR-191的克隆及过表达腺病毒的获得 | 第47-58页 |
| 5.1 引言 | 第47页 |
| 5.2 实验材料与方法 | 第47-50页 |
| 5.2.1 生化实验所用试剂和配方 | 第47页 |
| 5.2.2 猪miR-191基因序列的扩增及回收 | 第47-48页 |
| 5.2.3 T-pre-miR-191载体的构建 | 第48页 |
| 5.2.4 重组穿梭质粒的构建 | 第48-49页 |
| 5.2.5 重组腺病毒骨架载体的构建 | 第49页 |
| 5.2.6 重组腺病毒Ad-miR-191的包装、扩繁及滴度测定 | 第49-50页 |
| 5.3 结果 | 第50-57页 |
| 5.3.1 猪pre-miR-191的克隆和鉴定 | 第50页 |
| 5.3.2 pre-miR-191序列与T载体连接 | 第50-51页 |
| 5.3.3 pre-miR-191序列二级结构预测 | 第51-52页 |
| 5.3.4 重组腺病毒表达载体的构建 | 第52-55页 |
| 5.3.5 重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定 | 第55-57页 |
| 5.4 讨论与小结 | 第57-58页 |
| 第六章 过表达miR-191对猪脂肪细胞分化的影响 | 第58-65页 |
| 6.1 前言 | 第58页 |
| 6.2 实验材料与方法 | 第58-59页 |
| 6.2.1 实验材料 | 第59页 |
| 6.2.2 实验方法 | 第59页 |
| 6.3 结果 | 第59-63页 |
| 6.3.1 miR-191对猪前体脂肪细胞分化的影响 | 第59-60页 |
| 6.3.2 过表达miR-191对成脂关键基因mRNA表达的影响 | 第60-62页 |
| 6.3.3 miR-191对猪前体脂肪细胞分化过程中成脂关键基因蛋白表达的影响 | 第62-63页 |
| 6.4 讨论 | 第63页 |
| 6.5 小结 | 第63-65页 |
| 第七章 预测miR-191与脂肪细胞形成相关的靶基因 | 第65-73页 |
| 7.1 前言 | 第65页 |
| 7.2 方法 | 第65-66页 |
| 7.2.1 miR-191靶基因的预测及生物信息学分析 | 第65页 |
| 7.2.2 预测miR-191与其靶基因的可接近性 | 第65-66页 |
| 7.2.3 预测调控miR-191的基因 | 第66页 |
| 7.3 结果 | 第66-71页 |
| 7.3.1 利用软件预测miR-191与成脂相关的靶基因 | 第66-67页 |
| 7.3.2 保守性及其靶基因位点分析 | 第67-68页 |
| 7.3.3 miR-191与靶基因mRNA的可接近性分析 | 第68-69页 |
| 7.3.4 调控miR-191表达的基因网络分析 | 第69-70页 |
| 7.3.5 miR-191其他与成脂相关靶基因的搜索 | 第70-71页 |
| 7.4 讨论 | 第71页 |
| 7.5 小结 | 第71-73页 |
| 第八章 miR-191与猪C/EBPβ 3'UTR的作用机制研究 | 第73-86页 |
| 8.1 背景 | 第73页 |
| 8.2 实验方法 | 第73-77页 |
| 8.2.1 猪C/EBPβ 3'UTR的克隆 | 第73-74页 |
| 8.2.2 T-C/EBPβ 3'UTR载体的构建 | 第74-76页 |
| 8.2.3 pGL3-C/EBPβ 3'UTR载体的构建 | 第76-77页 |
| 8.2.4 双荧光素酶报告基因活性检测 | 第77页 |
| 8.2.5 脂肪细胞分化过程中miR-191对C/EBPβ蛋白表达水平的影响 | 第77页 |
| 8.3 实验结果 | 第77-83页 |
| 8.3.1 miR-191的靶基因预测结果 | 第77-78页 |
| 8.3.2 猪C/EBPβ 3'UTR的克隆 | 第78页 |
| 8.3.3 猪C/EBPβ 3'UTR与pMD 19-T载体连接 | 第78-79页 |
| 8.3.4 猪pGL3-C/EBPβ 3'UTR载体的鉴定 | 第79-82页 |
| 8.3.5 双荧光素酶报告系统检测及分析 | 第82-83页 |
| 8.3.6 过表达miR-191直接下调C/EBPβ蛋白水平 | 第83页 |
| 8.4 讨论 | 第83-84页 |
| 8.5 实验结论 | 第84页 |
| 8.6 总结 | 第84-86页 |
| 结论 | 第86-87页 |
| 创新点 | 第87-88页 |
| 进一步研究内容 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-101页 |
| 附录 | 第101-136页 |
| 附录1 主要实验仪器设备与器械 | 第101-102页 |
| 附录2 实验材料 | 第102-103页 |
| 附录3 生化试验所用试剂和配方 | 第103-104页 |
| 附录4 细胞培养所用试剂和配方 | 第104-105页 |
| 附录5 Western Blot所用试剂 | 第105-107页 |
| 附录6 细胞中总蛋白的提取及所用抗体信息 | 第107-108页 |
| 附录7 蛋白浓度测定 | 第108-109页 |
| 附录8 Western blot分析 | 第109-110页 |
| 附录9 猪前体脂肪细胞的分离获得与培养 | 第110-111页 |
| 附录10 猪前体脂肪细胞的培养及诱导分化和油红O染色分析 | 第111-112页 |
| 附录11 TRIzol法提取总RNA | 第112-113页 |
| 附录12 反转录及Real time-qPCR | 第113-117页 |
| 附录13 DNA片段胶回收 | 第117-118页 |
| 附录14 质粒小量提取 | 第118-119页 |
| 附录15 乙醇沉淀回收 | 第119-120页 |
| 附录16 T载体克隆和转化 | 第120-121页 |
| 附录17 制备含pAd-Easy的感受态细胞及穿梭载体与骨架载体的重组 | 第121-122页 |
| 附录18 腺病毒包装 | 第122-123页 |
| 附录19 重组腺病毒Ad-miR-191的扩繁、鉴定及病毒滴度测定 | 第123-124页 |
| 附录20 序列信息及测序峰谱图 | 第124-133页 |
| 附录21 双荧光素酶报告基因系统检测分析 | 第133-135页 |
| 附录22 数据统计学分析 | 第135-136页 |
| 缩略词表 | 第136-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 作者简介 | 第139页 |
