| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 中国小麦花叶病毒(CWMV)的研究概况 | 第13-17页 |
| 1.1.1 CWMV田间症状 | 第13页 |
| 1.1.2 CWMV基因组结构 | 第13-14页 |
| 1.1.3 CWMV编码的蛋白 | 第14-16页 |
| 1.1.3.1 病毒复制酶(Viral Replicase) | 第14-15页 |
| 1.1.3.2 运动蛋白(MP) | 第15页 |
| 1.1.3.3 外壳蛋白及其相关蛋白 | 第15-16页 |
| 1.1.3.4 富含半胱氨酸蛋白(CRP) | 第16页 |
| 1.1.4 CWMV sRNA | 第16-17页 |
| 1.2 热休克蛋白HSP70研究概况 | 第17-21页 |
| 1.2.1 HSP70结构 | 第17-18页 |
| 1.2.2 HSP70的功能 | 第18-19页 |
| 1.2.3 HSP70与病毒侵染 | 第19-21页 |
| 1.2.3.1 HSP70对病毒复制的影响 | 第19-20页 |
| 1.2.3.2 HSP70对病毒运动的影响 | 第20-21页 |
| 1.3 本文研究的目的与意义 | 第21-22页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第22-36页 |
| 2.1 材料 | 第22-23页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第22页 |
| 2.1.2 主要试剂、培养基、仪器等 | 第22-23页 |
| 2.2 实验的方法 | 第23-36页 |
| 2.2.1 目的基因的克隆 | 第23-24页 |
| 2.2.1.1 基因PCR扩增 | 第23页 |
| 2.2.1.2 PCR产物检测与回收纯化 | 第23-24页 |
| 2.2.2 构建载体 | 第24-27页 |
| 2.2.2.1 将目的片段连接克隆载体 | 第24-25页 |
| 2.2.2.2 质粒或者连接产物转化大肠杆菌 | 第25页 |
| 2.2.2.3 鉴定阳性克隆、测序 | 第25-26页 |
| 2.2.2.4 提取大肠杆菌的质粒 | 第26页 |
| 2.2.2.5 将载体进行双酶切 | 第26-27页 |
| 2.2.3 重组质粒转化至酵母菌株中 | 第27-28页 |
| 2.2.4 体外转录产物接种 | 第28页 |
| 2.2.5 农杆菌感受态细胞的制备 | 第28页 |
| 2.2.6 将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中 | 第28-29页 |
| 2.2.7 农杆菌浸润接种 | 第29页 |
| 2.2.8 Quercetin处理 | 第29页 |
| 2.2.9 荧光观察 | 第29-30页 |
| 2.2.10 Western blot | 第30页 |
| 2.2.11 提取Total RNA | 第30-31页 |
| 2.2.12 Northern blot | 第31-32页 |
| 2.2.13 病毒粒子提取 | 第32页 |
| 2.2.14 电镜观察 | 第32页 |
| 2.2.15 体外转录反应 | 第32-33页 |
| 2.2.16 诱导目的蛋白原核表达 | 第33页 |
| 2.2.17 荧光定量PCR | 第33-34页 |
| 2.2.18 植物细胞质、细胞核提取 | 第34页 |
| 2.2.19 细胞膜蛋白提取 | 第34-36页 |
| 第3章 中国小麦花叶病毒(CWMV)全长侵染性克隆的构建 | 第36-50页 |
| 3.1 引言 | 第36页 |
| 3.2 材料与方法 | 第36-41页 |
| 3.2.1 材料 | 第37页 |
| 3.2.2 方法 | 第37-41页 |
| 3.2.2.1 引物设计 | 第37-38页 |
| 3.2.2.2 病毒分离和病毒粒子的提取 | 第38页 |
| 3.2.2.3 目的基因的扩增及纯化 | 第38-39页 |
| 3.2.2.4 重组载体的构建 | 第39页 |
| 3.2.2.5 体外转录反应 | 第39页 |
| 3.2.2.6 体外转录产物接种 | 第39-40页 |
| 3.2.2.7 重组质粒电击转化感受态细胞 | 第40页 |
| 3.2.2.8 农杆菌浸润接种 | 第40页 |
| 3.2.2.9 病毒粒子电镜观察 | 第40页 |
| 3.2.2.10 Western blot | 第40页 |
| 3.2.2.11 Northern blot | 第40-41页 |
| 3.3 结果与分析 | 第41-49页 |
| 3.3.1 全长CWMV cDNA扩增与克隆 | 第41页 |
| 3.3.2 CWMV cDNA克隆体外转录及其侵染性分析 | 第41-45页 |
| 3.3.3 农杆菌浸润法接种CWMV侵染性克隆 | 第45-48页 |
| 3.3.4 应用全长侵染性克隆分析CWMV温敏性 | 第48-49页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第49-50页 |
| 第4章 HSP70表达特性与CWMV侵染之间的关系分析 | 第50-65页 |
| 4.1 引言 | 第50页 |
| 4.2 材料与方法 | 第50-54页 |
| 4.2.1 材料 | 第51页 |
| 4.2.2 方法 | 第51-54页 |
| 4.2.2.1 设计引物 | 第51-52页 |
| 4.2.2.2 Trizol法提取植物RNA | 第52页 |
| 4.2.2.3 扩增目的基因及纯化 | 第52页 |
| 4.2.2.4 克隆载体的构建 | 第52-53页 |
| 4.2.2.5 基因沉默载体TRV:NbHSP70的构建 | 第53页 |
| 4.2.2.6 瞬时过表达载体35S:NbHSP70和35S:TaHSP70构建 | 第53页 |
| 4.2.2.7 Northern blot | 第53页 |
| 4.2.2.8 Western blot | 第53-54页 |
| 4.2.2.9 荧光定量PCR | 第54页 |
| 4.3 结果与分析 | 第54-63页 |
| 4.3.1 CWMV侵染对宿主HSP70蛋白积累水平的影响 | 第54-55页 |
| 4.3.2 抑制HSP70蛋白的积累对CWMV复制的影响 | 第55-56页 |
| 4.3.3 CWMV侵染对HSP70的转录水平的影响 | 第56-59页 |
| 4.3.4 沉默NbHSP70对CWMV复制的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.5 TaHSP70和NbHSP70过表达对CWMV的复制的影响 | 第60-62页 |
| 4.3.6 NbHSP70对CWMV的RNA1复制的影响 | 第62-63页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第63-65页 |
| 第5章 HSP70和CWMV复制酶的互作分析 | 第65-85页 |
| 5.1 引言 | 第65页 |
| 5.2 材料与方法 | 第65-71页 |
| 5.2.1 材料 | 第65-66页 |
| 5.2.2 方法 | 第66-71页 |
| 5.2.2.1 引物设计 | 第66-67页 |
| 5.2.2.2 扩增与纯化目的基因 | 第67-69页 |
| 5.2.2.3 构建重组载体 | 第69-70页 |
| 5.2.2.4 转化农杆菌感受态 | 第70页 |
| 5.2.2.5 农杆菌浸润接种 | 第70页 |
| 5.2.2.6 荧光观察 | 第70页 |
| 5.2.2.7 质粒转化酵母菌株 | 第70页 |
| 5.2.2.8 ELISA实验 | 第70-71页 |
| 5.2.2.9 Western blot | 第71页 |
| 5.3 结果与分析 | 第71-83页 |
| 5.3.1 HSP70和CWMV复制酶的酵母双杂交实验分析 | 第71-73页 |
| 5.3.2 基于ELISA的体外互作分析 | 第73-76页 |
| 5.3.2.1 原核表达载体的构建 | 第73-74页 |
| 5.3.2.2 pGEX-Rep~(1-333)、pET-HSP70蛋白诱导表达 | 第74-75页 |
| 5.3.2.3 ELISA-based binding assays | 第75-76页 |
| 5.3.3 双分子荧光互补实验BiFC | 第76-78页 |
| 5.3.4 NbHSP70和TaHSP70的定位分析 | 第78-79页 |
| 5.3.5 HSP70与CWMV复制酶的细胞定位分析 | 第79-83页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第83-85页 |
| 第6章 总结与展望 | 第85-87页 |
| 6.1 总结 | 第85页 |
| 6.2 展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-99页 |
| 附录 | 第99-113页 |
| 致谢 | 第113-115页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第115-119页 |
