| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略词注释表 | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 脂肪酶概述 | 第12-18页 |
| 1.1.1 根霉脂肪酶简介 | 第12页 |
| 1.1.2 根霉脂肪酶的结构特征 | 第12-13页 |
| 1.1.3 脂肪酶前导肽的结构与功能 | 第13-15页 |
| 1.1.4 脂肪酶的盖子结构与动力学 | 第15-17页 |
| 1.1.5 有机溶剂对脂肪酶动力学的影响 | 第17-18页 |
| 1.2 核磁共振技术研究蛋白质结构功能现状 | 第18-21页 |
| 1.2.1 核磁共振技术解析蛋白结构 | 第18-19页 |
| 1.2.2 核磁共振技术研究蛋白动态变化 | 第19-20页 |
| 1.2.3 核磁共振方法研究巴斯德毕赤酵母代谢通量 | 第20-21页 |
| 1.3 同位素标记蛋白表达研究现状 | 第21-23页 |
| 1.3.1 大肠杆菌中同位素标记蛋白表达的研究 | 第21-22页 |
| 1.3.2 毕赤酵母中同位素标记蛋白表达的研究 | 第22-23页 |
| 1.4 本课题立题依据及主要研究内容 | 第23-25页 |
| 1.4.1 本研究的目的和意义 | 第23-24页 |
| 1.4.2 本研究的主要研究内容 | 第24-25页 |
| 第二章 华根霉脂肪酶晶体结构解析 | 第25-34页 |
| 2.1 前言 | 第25页 |
| 2.2 材料与方法 | 第25-27页 |
| 2.2.1 菌种与质粒 | 第25页 |
| 2.2.2 培养基及缓冲 | 第25页 |
| 2.2.3 主要试剂及仪器 | 第25-26页 |
| 2.2.4 目的蛋白的表达及纯化 | 第26页 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定 | 第26-27页 |
| 2.2.6 酶活力测定 | 第27页 |
| 2.2.7 目的蛋白结晶的条件筛选及结晶 | 第27页 |
| 2.2.8 X射线衍射数据收集与处理 | 第27页 |
| 2.2.9 晶体结构解析 | 第27页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第27-32页 |
| 2.3.1 RCL的表达与分离纯化 | 第27-28页 |
| 2.3.2 RCL纯酶蛋白浓度及酶活测定 | 第28页 |
| 2.3.3 RCL结晶浓度及结晶条件筛选 | 第28-29页 |
| 2.3.4 RCL的结晶条件优化 | 第29-30页 |
| 2.3.5 衍射数据的收集 | 第30页 |
| 2.3.6 衍射数据修正 | 第30页 |
| 2.3.7 晶体结构解析 | 第30-32页 |
| 2.4 本章小结 | 第32-34页 |
| 第三章 同位素标记脂肪酶在毕赤酵母中表达及代谢通量分析 | 第34-52页 |
| 3.1 前言 | 第34页 |
| 3.2 材料与方法 | 第34-38页 |
| 3.2.1 菌种与质粒 | 第34页 |
| 3.2.2 培养基及溶液 | 第34-35页 |
| 3.2.3 主要试剂及仪器 | 第35页 |
| 3.2.4 未标记r27RCL在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第35页 |
| 3.2.5 未标记r27RCL在基础培养基的表达优化 | 第35页 |
| 3.2.6 ~(15)N-标记r27RCL在基础培养基的表达 | 第35页 |
| 3.2.7 ~(15)N-标记r27RCL的样品制备及[~1H,~(15)N]-TROSY-HSQC图谱采集 | 第35页 |
| 3.2.8 ~(13)C, ~(15)N-双标记r27RCL在毕赤酵母中的表达及纯化 | 第35-36页 |
| 3.2.9 ~(13)C, ~(15)N-双标记r27RCL的样品制备及图谱采集 | 第36页 |
| 3.2.10 利用MALDI-TOF测定r27RCL蛋白分子量 | 第36页 |
| 3.2.11 糖基化分析 | 第36-37页 |
| 3.2.12 ~2H-标记RCL的表达及纯化 | 第37页 |
| 3.2.13 毕赤酵母代谢通量分析 | 第37-38页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第38-50页 |
| 3.3.1 未标记r27RCL在基础培养基的表达优化 | 第38-39页 |
| 3.3.2 ~(15)N-标记r27RCL的表达纯化及[~1H,~(15)N]-TROSY-HSQC图谱采集 | 第39-40页 |
| 3.3.3 ~(13)C, ~(15)N-双标记r27RCL的表达纯化及NMR图谱采集 | 第40-43页 |
| 3.3.4 毕赤酵母表达的r27RCL的糖基化分析 | 第43页 |
| 3.3.5 ~2H-标记RCL的表达及纯化 | 第43-44页 |
| 3.3.6 毕赤酵母代谢通量分析 | 第44-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-52页 |
| 第四章 同位素标记脂肪酶在大肠杆菌中的表达与化学位移归属 | 第52-68页 |
| 4.1 前言 | 第52页 |
| 4.2 材料与方法 | 第52-57页 |
| 4.2.1 菌种与质粒 | 第52页 |
| 4.2.2 主要试剂及仪器 | 第52页 |
| 4.2.3 培养基及溶液 | 第52-54页 |
| 4.2.4 未标记r27RCL在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第54页 |
| 4.2.5 ~(13)C, ~(15)N-双标记RCL在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第54-55页 |
| 4.2.6 主链~2H,~(13)C, ~(15)N-及Ile-δ1,Leu,Val侧链~1H,~(13)C标记RCL的表达及纯化 | 第55页 |
| 4.2.7 二硫键分析 | 第55页 |
| 4.2.8 NMR样品制备 | 第55页 |
| 4.2.9 NMR图谱采集 | 第55-56页 |
| 4.2.10 化学位移归属及验证 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-67页 |
| 4.3.1 未标记r27RCL在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第57-58页 |
| 4.3.2 大肠杆菌表达r27RCL的二硫键分析 | 第58-59页 |
| 4.3.3 ~(13)C, ~(15)N-标记r27RCL在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第59-60页 |
| 4.3.4 NMR图谱采集与处理 | 第60-61页 |
| 4.3.5 主链~2H,~(13)C,~(15)N-及Ile-δ1,Leu,Val侧链~(13)C标记RCL的表达及纯化 | 第61-62页 |
| 4.3.6 化学位移归属及验证 | 第62-67页 |
| 4.3.7 毕赤酵母与大肠杆菌表达系统对表达同位素标记蛋白的比较 | 第67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第五章 溶液状态下华根霉脂肪酶的结构与功能分析 | 第68-87页 |
| 5.1 前言 | 第68页 |
| 5.2 材料与方法 | 第68-72页 |
| 5.2.1 毕赤酵母Kex2蛋白酶的基因调取、构建与表达 | 第68-69页 |
| 5.2.2 前导肽缺失残基结构补全及开盖构象模拟 | 第69-70页 |
| 5.2.3 RCL前导肽和盖子及主体蛋白之间NOE数据分析 | 第70页 |
| 5.2.4 ~(15)N NMR驰豫图谱采集及处理 | 第70-71页 |
| 5.2.5 脂肪酶r27RCL和mRCL在毕赤酵母中的表达 | 第71页 |
| 5.2.6 RCL前导肽突变体的构建 | 第71-72页 |
| 5.2.7 RCL前导肽突变体的表达纯化及动力学参数测定 | 第72页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第72-85页 |
| 5.3.1 毕赤酵母Kex2蛋白酶的基因调取、构建与表达 | 第72-74页 |
| 5.3.2 溶液状态下RCL盖子及前导肽动力学分析 | 第74-78页 |
| 5.3.3 华根霉脂肪酶前导肽构效关系 | 第78-85页 |
| 5.4 本章小结 | 第85-87页 |
| 第六章 有机溶剂对华根霉脂肪酶结构及动态影响 | 第87-94页 |
| 6.1 前言 | 第87页 |
| 6.2 材料与方法 | 第87-88页 |
| 6.2.1 主要试剂及仪器 | 第87页 |
| 6.2.2 动力学参数测定 | 第87页 |
| 6.2.3 加入有机溶剂的NMR样品制备、图谱采集与数据处理 | 第87-88页 |
| 6.2.4 NMR图谱处理及在晶体结构上的绘制 | 第88页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第88-93页 |
| 6.3.1 不同有机溶剂对RCL的动力学影响 | 第88页 |
| 6.3.2 有机溶剂对RCL动态影响 | 第88-91页 |
| 6.3.3 有机溶剂对RCL微环境影响 | 第91-93页 |
| 6.4 本章小结 | 第93-94页 |
| 主要结论与展望 | 第94-97页 |
| 主要结论 | 第94-96页 |
| 展望 | 第96-97页 |
| 论文创新点 | 第97-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-110页 |
| 附录: 表 | 第110-129页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第129-130页 |
