| 致谢 | 第6-7页 |
| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第15-35页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 人类免疫缺陷病毒HIV | 第15-25页 |
| 1.2.1 HIV的发现 | 第15-17页 |
| 1.2.2 HIV的形态结构 | 第17-18页 |
| 1.2.3 HIV的基因组结构 | 第18-20页 |
| 1.2.4 HIV入侵细胞的机制和致病机理 | 第20-21页 |
| 1.2.5 HIV的分型及分布 | 第21-23页 |
| 1.2.6 全球艾滋病流行现状 | 第23-25页 |
| 1.3 HIV-1跨膜蛋白gp41 | 第25-29页 |
| 1.3.1 HIV-1 gp41的结构和功能 | 第25-27页 |
| 1.3.2 HIV-1 gp41的抗原表位 | 第27-28页 |
| 1.3.3 gp41在HIV诊断检测中的应用 | 第28-29页 |
| 1.4 膜蛋白表达研究的策略 | 第29-33页 |
| 1.4.1 体内融合表达策略 | 第30页 |
| 1.4.2 体外无细胞体系表达策略 | 第30-33页 |
| 1.5 本课题的基本思路和研究内容 | 第33-35页 |
| 第二章 材料与方法 | 第35-43页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-38页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第35页 |
| 2.1.2 质粒 | 第35页 |
| 2.1.3 主要试剂及工具酶 | 第35-36页 |
| 2.1.4 培养基 | 第36页 |
| 2.1.5 分子生物学实验溶液配制 | 第36-37页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第37-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-43页 |
| 2.2.1 分子克隆实验 | 第38-40页 |
| 2.2.2 细胞密度的测定 | 第40页 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳 | 第40页 |
| 2.2.4 Western blotting分析 | 第40-41页 |
| 2.2.5 大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备 | 第41-43页 |
| 第三章 HIV-1 gp41在大肠杆菌体内的截短融合表达 | 第43-55页 |
| 3.1 引言 | 第43-44页 |
| 3.2 实验材料 | 第44页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第44页 |
| 3.2.2 试剂及工具酶 | 第44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.3.1 模板合成及目的基因选择 | 第44-45页 |
| 3.3.2 引物设计 | 第45-46页 |
| 3.3.3 PCR扩增目的基因 | 第46页 |
| 3.3.4 融合表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.5 大肠杆菌体系诱导表达gp41融合蛋白 | 第47页 |
| 3.3.6 细胞破碎 | 第47页 |
| 3.3.7 SDS-PAGE与Western blotting | 第47-48页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第48-54页 |
| 3.4.1 gp41截短基因的扩增 | 第48页 |
| 3.4.2 pET-39b(+)-gp41-T融合表达载体的构建 | 第48-49页 |
| 3.4.3 gp41融合蛋白的诱导表达 | 第49-51页 |
| 3.4.4 诱导温度对gp41融合蛋白表达的影响 | 第51-52页 |
| 3.4.5 IPTG浓度对gp41融合蛋白表达的影响 | 第52-53页 |
| 3.4.6 诱导后培养时间对gp41融合蛋白表达的影响 | 第53-54页 |
| 3.5 本章小结 | 第54-55页 |
| 第四章 HIV-1 gp41在大肠杆菌体外无细胞体系的高效表达 | 第55-71页 |
| 4.1 引言 | 第55页 |
| 4.2 实验材料 | 第55-56页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第55-56页 |
| 4.2.2 试剂及工具酶 | 第56页 |
| 4.3 实验方法 | 第56-60页 |
| 4.3.1 引物设计 | 第56页 |
| 4.3.2 目的基因的克隆 | 第56页 |
| 4.3.3 无细胞重组表达载体的构建 | 第56-57页 |
| 4.3.4 制备大肠杆菌无细胞体系抽提物 | 第57页 |
| 4.3.5 大肠杆菌无细胞反应体系配置 | 第57-59页 |
| 4.3.6 无细胞体系表达gp41 | 第59页 |
| 4.3.7 去污剂重悬无细胞体系表达的膜蛋白沉淀(P-CF模式) | 第59页 |
| 4.3.8 无细胞体系添加去污剂可溶表达gp41(D-CF模式) | 第59-60页 |
| 4.3.9 SDS-PAGE | 第60页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第60-69页 |
| 4.4.1 gp41全长基因的克隆 | 第60-61页 |
| 4.4.2 pIVEX2.4c-gp41无细胞表达载体的构建 | 第61-62页 |
| 4.4.3 gp41蛋白的无细胞体系表达 | 第62-63页 |
| 4.4.4 去污剂重悬表达可溶性gp41 | 第63-64页 |
| 4.4.5 直接在无细胞体系添加去污剂表达可溶性gp41 | 第64-66页 |
| 4.4.6 Brij78浓度对无细胞体系可溶性表达gp41的影响 | 第66-67页 |
| 4.4.7 反应时间对无细胞体系可溶表达gp41的影响 | 第67-68页 |
| 4.4.8 无细胞体系两种表达可溶性gp41模式的比较 | 第68-69页 |
| 4.5 本章小结 | 第69-71页 |
| 第五章 gp41重组蛋白的分离纯化及其免疫反应性的初步检测 | 第71-81页 |
| 5.1 引言 | 第71-72页 |
| 5.2 实验材料 | 第72页 |
| 5.2.1 质粒 | 第72页 |
| 5.2.2 试剂 | 第72页 |
| 5.3 实验方法 | 第72-75页 |
| 5.3.1 可溶性gp41的制备表达 | 第72页 |
| 5.3.2 Ni-NTA亲和层析纯化gp41 | 第72-73页 |
| 5.3.3 纯化后蛋白的浓缩和缓冲液替换 | 第73-74页 |
| 5.3.4 蛋白浓度的测定 | 第74页 |
| 5.3.5 SDS-PAGE | 第74页 |
| 5.3.6 乳胶法试纸的制备 | 第74页 |
| 5.3.7 gp41重组蛋白的反应性检测 | 第74页 |
| 5.3.8 gp41重组蛋白的灵敏度检测 | 第74-75页 |
| 5.3.9 gp41重组蛋白的特异性检测 | 第75页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第75-79页 |
| 5.4.1 gp41重组蛋白的纯化 | 第75-76页 |
| 5.4.2 gp41重组蛋白的浓缩和替换缓冲液 | 第76页 |
| 5.4.3 gp41重组蛋白的反应性检测 | 第76-77页 |
| 5.4.4 gp41重组蛋白的灵敏度检测 | 第77-78页 |
| 5.4.5 gp41重组蛋白的特异性检测 | 第78-79页 |
| 5.5 本章小结 | 第79-81页 |
| 第六章 结论与展望 | 第81-85页 |
| 6.1 结论 | 第81-82页 |
| 6.2 展望 | 第82-85页 |
| 参考文献 | 第85-99页 |
| 作者简介 | 第99页 |
