| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 文献综述 | 第10-18页 |
| 1.1 咖啡碱概述 | 第10-11页 |
| 1.1.1 植物中的咖啡碱及其生理功能 | 第10页 |
| 1.1.2 茶树中的咖啡碱及其生理功能 | 第10-11页 |
| 1.1.3 咖啡碱的药理功效及对人体的影响 | 第11页 |
| 1.2 咖啡碱合成代谢研究进展 | 第11-14页 |
| 1.2.1 咖啡碱的生物合成途径 | 第11-12页 |
| 1.2.2 咖啡碱合成过程中关键酶的研究进展 | 第12-14页 |
| 1.2.2.1 甲基供体S-腺苷蛋氨酸及S-腺苷甲硫氨酸合成酶 | 第12页 |
| 1.2.2.2 核糖核苷水解酶研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2.2.3 N-甲基转移酶研究进展 | 第13-14页 |
| 1.3 咖啡碱的综合利用研究进展 | 第14-16页 |
| 1.3.1 咖啡碱制备方法研究进展 | 第14-15页 |
| 1.3.2 脱(低)咖啡碱茶的开发利用 | 第15页 |
| 1.3.3 转基因作物的研究 | 第15-16页 |
| 1.4 大肠杆菌表达系统 | 第16-18页 |
| 1.4.1 大肠杆菌表达系统研究进展 | 第16页 |
| 1.4.2 多基因在大肠杆菌中的组合表达 | 第16-18页 |
| 2 引言 | 第18-21页 |
| 2.1 研究意义 | 第18-19页 |
| 2.2 研究内容 | 第19页 |
| 2.2.1 咖啡碱生物合成相关酶CaXMT和TCS1的克隆与功能验证 | 第19页 |
| 2.2.2 咖啡碱生物合成相关酶CaXMT和TCS1在大肠杆菌中的组合表达 | 第19页 |
| 2.2.3 茶树咖啡碱合成酶TCS1的定点突变及体外表达研究 | 第19页 |
| 2.3 技术路线 | 第19-21页 |
| 3 材料与方法 | 第21-33页 |
| 3.1 材料 | 第21-22页 |
| 3.1.1 菌株与载体 | 第21页 |
| 3.1.2 仪器与试剂 | 第21-22页 |
| 3.2 方法 | 第22-33页 |
| 3.2.1 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1表达载体的构建及体外酶活检测 | 第22-30页 |
| 3.2.1.1 引物的设计与合成 | 第22页 |
| 3.2.1.2 PCR扩增CaXMT和TCS1基因序列 | 第22-23页 |
| 3.2.1.3 PCR产物的凝胶回收纯化 | 第23页 |
| 3.2.1.4 回收片段未端加A | 第23页 |
| 3.2.1.5 加A后产物与克隆载体pMD19-T的连接及转化 | 第23-24页 |
| 3.2.1.6 阳性转化子的鉴定 | 第24-25页 |
| 3.2.1.7 重组表达载体pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1的构建 | 第25-27页 |
| 3.2.1.8 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1融合蛋白的诱导表达 | 第27-28页 |
| 3.2.1.9 融合蛋白诱导条件的优化 | 第28-29页 |
| 3.2.1.10 体外酶活性检测 | 第29-30页 |
| 3.2.2 pMAL-CaXMT-TCS1双基因融合表达载体的构建及生物学活性分析 | 第30-32页 |
| 3.2.2.1 双基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1的构建与鉴定 | 第30-31页 |
| 3.2.2.2 pMAL-CaXMT-TCS1融合蛋白的诱导表达 | 第31页 |
| 3.2.2.3 pMAL-CaXMT&TCS1双基因融合蛋白的体外酶活性分析 | 第31-32页 |
| 3.2.2.4 pMAL-CaXMT-TCS1双基因融合蛋白的体内酶活性分析 | 第32页 |
| 3.2.3 茶树咖啡碱合成酶基因TCS1的定点突变及体外表达分析 | 第32-33页 |
| 3.2.3.1 TCS1突变位点的确定 | 第32页 |
| 3.2.3.2 TCS1突变体的突变PCR反应 | 第32页 |
| 3.2.3.3 突变基因的诱导表达 | 第32页 |
| 3.2.3.4 突变基因的体外酶活性分析 | 第32-33页 |
| 4 结果与分析 | 第33-51页 |
| 4.1 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1表达载体的构建及体外酶活性分析 | 第33-38页 |
| 4.1.1 CaXMT和TCS1基因ORF的扩增 | 第33-34页 |
| 4.1.2 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1表达载体的构建 | 第34页 |
| 4.1.3 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1在大肠杆菌中的诱导表达 | 第34-36页 |
| 4.1.4 pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1的体外酶活性分析 | 第36-38页 |
| 4.2 pMAL-CaXMT-TCS1表达载体的构建及生物学活性分析 | 第38-46页 |
| 4.2.1 pMAL-CaXMT-TCS1表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 4.2.2 pMAL-CaXMT-TCS1组合表达载体的SDS-PAGE凝胶电泳分析 | 第39-40页 |
| 4.2.3 pMAL-CaXMT-TCS1组合表达载体的生物学活性分析 | 第40-46页 |
| 4.2.3.1 体外酶活性检测 | 第40-44页 |
| 4.2.3.2 体外酶反应条件的优化 | 第44-45页 |
| 4.2.3.3 体内喂养活性检测 | 第45-46页 |
| 4.3 茶树咖啡碱合成酶TCS1的定点突变及体外表达分析 | 第46-51页 |
| 4.3.1 TCS1基因突变位点的确定 | 第46-47页 |
| 4.3.2 突变体TMx的PCR扩增及突变位点的鉴定 | 第47-48页 |
| 4.3.3 突变体pMAL-TMx在大肠杆菌中的诱导表达 | 第48-49页 |
| 4.3.4 突变体pMAL-TMx的体外酶活性分析 | 第49-51页 |
| 5 讨论 | 第51-53页 |
| 5.1 关于CaXMT和TCS1生物信息学分析 | 第51页 |
| 5.2 双基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1的构建及其表达研究 | 第51-52页 |
| 5.2.1 双基因共表达体系的设计 | 第51页 |
| 5.2.2 原核表达系统的选择 | 第51-52页 |
| 5.3 关于茶树咖啡碱合成酶TCS1基因的定点突变 | 第52-53页 |
| 6 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-59页 |
| 附录A. 中英文缩写及注释 | 第59-61页 |
| 附录B. CaXMT与TCS1基因的测序结果 | 第61-63页 |
| 附录C. TCS1的突变体TMx的测序结果 | 第63-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 作者简介 | 第67页 |
