| 符号说明 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-22页 |
| 1.1 前言 | 第13-14页 |
| 1.2 47 kDa尾连蛋白(tail-interacting protein of 47 kDa,TIP47) | 第14-16页 |
| 1.3 TIP47与脂滴 | 第16-18页 |
| 1.4 CRISPR/Cas9 | 第18-22页 |
| 第2章 实验仪器和实验材料与试剂 | 第22-24页 |
| 2.1 实验仪器 | 第22页 |
| 2.2 实验材料和试剂 | 第22-24页 |
| 第3章 实验方法与步骤 | 第24-57页 |
| 3.1 运用CRISPR/Cas9技术敲除mouse C2C12 myoblasts中的TIP47 | 第24-48页 |
| 3.1.1 构建CRISPR/Cas9质粒pX260a-TIP47 | 第24-25页 |
| 3.1.1.1 Bbs I酶切pX260a | 第24页 |
| 3.1.1.2 Cas9引物的设计 | 第24页 |
| 3.1.1.3 引物退火 | 第24-25页 |
| 3.1.1.4 Cas9质粒pX260a与Cas9退火引物进行酶连反应 | 第25页 |
| 3.1.2 CRISPR/Cas9质粒pX260a-TIP47转化TOP10大肠杆菌感受态细胞 | 第25-27页 |
| 3.1.3 挑取阳性克隆并测序验证 | 第27页 |
| 3.1.4 大提质粒pX260a-TIP47 | 第27-28页 |
| 3.1.4.1 质粒提取 | 第27-28页 |
| 3.1.4.2 质粒纯化 | 第28页 |
| 3.1.5 小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12(mouse C2C12 myoblasts)的培养 | 第28-29页 |
| 3.1.6 CRISPR/Cas9质粒pX260a-TIP47电转mouse C2C12 myoblasts并鉴定 | 第29页 |
| 3.1.7 细胞冻存和复苏 | 第29-31页 |
| 3.1.7.1 细胞冻存 | 第30页 |
| 3.1.7.2 细胞复苏 | 第30-31页 |
| 3.1.8 密度梯度稀释法从TIP47混合克隆细胞中筛选出TIP47 KO单克隆细胞 | 第31-32页 |
| 3.1.9 单克隆细胞的蛋白水平鉴定与基因水平鉴定 | 第32-48页 |
| 3.1.9.1 单克隆细胞的蛋白水平鉴定 | 第32-41页 |
| 3.1.9.1.1 蛋白印迹杂交的原理 | 第32-33页 |
| 3.1.9.1.2 SDS-PAGE的制备 | 第33-35页 |
| 3.1.9.1.3 蛋白质样品的制备 | 第35页 |
| 3.1.9.1.4 蛋白质电泳 | 第35-36页 |
| 3.1.9.1.5 转膜 | 第36-37页 |
| 3.1.9.1.6 膜的封闭 | 第37-38页 |
| 3.1.9.1.7 Colloidal blue染色 | 第38-39页 |
| 3.1.9.1.8 抗体杂交 | 第39-40页 |
| 3.1.9.1.8.1 一抗杂交过程 | 第39-40页 |
| 3.1.9.1.8.2 二抗杂交过程 | 第40页 |
| 3.1.9.1.9 曝光检测 | 第40-41页 |
| 3.1.9.1.9.1 辣根过氧化物酶-DAB法 | 第40页 |
| 3.1.9.1.9.2 辣根过氧化物酶-ECL法(HRP-ECL法) | 第40-41页 |
| 3.1.9.2 单克隆细胞的测序鉴定 | 第41-48页 |
| 3.1.9.2.1 单克隆细胞测序鉴定引物的设计 | 第41页 |
| 3.1.9.2.2 模板DNA的制备 | 第41-42页 |
| 3.1.9.2.3 TIP47目的片段的扩增 | 第42页 |
| 3.1.9.2.4 琼脂糖凝胶的配制 | 第42-43页 |
| 3.1.9.2.5 琼脂糖凝胶的电泳 | 第43-44页 |
| 3.1.9.2.6 琼脂糖凝胶回收TIP47DNA片段 | 第44-47页 |
| 3.1.9.2.7 琼脂糖凝胶回收TIP47 DNA片段与T载体酶连反应 | 第47-48页 |
| 3.1.9.2.8 酶连产物转化TOPI0感受态细胞 | 第48页 |
| 3.1.9.2.9 挑取阳性克隆并测序 | 第48页 |
| 3.2. 确定OA处理C2C12细胞和TIP47敲除细胞的的最佳浓度和最适时间 | 第48-52页 |
| 3.2.1 确定OA处理C2C12细胞及其TIP47敲除细胞的的最佳浓度 | 第48-49页 |
| 3.2.2 BCA法测定细胞样品蛋白质含量 | 第49-51页 |
| 3.2.3 甘油三酯测定试剂盒(GPO-PAP)测定细胞样品甘油三酯含量 | 第51页 |
| 3.2.4 确定OA处理C2C12细胞及其TIP47敲除细胞的的最适时间 | 第51-52页 |
| 3.3. 用LipidTOXTM Red对C2C12细胞中的脂滴进行染色观察 | 第52-54页 |
| 3.3.1 激光扫麟聚焦显微觀察用的盖餅的前处理 | 第52页 |
| 3.3.2 100mM OA溶液的制备 | 第52-53页 |
| 3.3.3 200μMOA细胞处理液的配制 | 第53页 |
| 3.3.4 C2C12 细跑传代培养 | 第53页 |
| 3.3.5 LipidTOX~(TM) Red染色并观察C2C12细胞中的脂滴 | 第53-54页 |
| 3.4 细胞脂滴的提取 | 第54-55页 |
| 3.5 SDS-PAGE银染 | 第55-56页 |
| 3.6 同位素示踪甘油三酯的合成代谢和水解代谢 | 第56-57页 |
| 第4章 实验结果与分析 | 第57-67页 |
| 4.1 CRISPR/Cas9技术操作流程 | 第57-58页 |
| 4.2 TIP47 KO细胞克隆的蛋白水平鉴定 | 第58-60页 |
| 4.3 TIP47 KO细胞克隆的基因测序鉴定 | 第60页 |
| 4.4 OA处理细胞的最佳浓度和最适时间 | 第60-61页 |
| 4.5 在OA刺激下,TIP47 KO引起细胞内脂质的增加 | 第61-62页 |
| 4.6 TIP47 KO TIW16细胞内蛋白质的差异表达 | 第62-63页 |
| 4.7 TIP47不响应OA的刺激 | 第63页 |
| 4.8 TIP47 KO细胞脂滴的银染 | 第63-64页 |
| 4.9 在OA的刺激下,TIP47 KO T1W16脂滴上的HSL、p-HSL和DGAT2表达增加 | 第64-65页 |
| 4.10 TIP47 KO导致C2C12细胞中TAG的累积 | 第65-67页 |
| 第5章 小结与讨论 | 第67-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
