| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 第1章 文献综述 | 第13-41页 |
| 1.1 洛伐他汀 | 第13-16页 |
| 1.1.1 洛伐他汀的结构与基本性质 | 第13页 |
| 1.1.2 洛伐他汀的生产制备 | 第13-14页 |
| 1.1.3 他汀类化合物的生物活性与用途 | 第14-16页 |
| 1.2 洛伐他汀的生物合成途径 | 第16-23页 |
| 1.2.1 洛伐他汀合成基因簇 | 第16-17页 |
| 1.2.2 LovB-LovC聚酮合酶系统的功能 | 第17-19页 |
| 1.2.3 聚酮合酶LovF的功能 | 第19-20页 |
| 1.2.4 酰基转移酶LovD的功能 | 第20-21页 |
| 1.2.5 LovA的功能 | 第21-22页 |
| 1.2.6 LovG的功能 | 第22-23页 |
| 1.2.7 洛伐他汀的生物合成路径 | 第23页 |
| 1.3 酵母细胞工厂异源合成次级代谢产物 | 第23-33页 |
| 1.3.1 异源生物合成途径的组装 | 第25-27页 |
| 1.3.2 酵母系统中异源基因的表达调控 | 第27-29页 |
| 1.3.3 酵母代谢调控及高通量筛选提升次级代谢产物合成 | 第29-30页 |
| 1.3.4 异源合成途径的区域化搭建 | 第30-32页 |
| 1.3.5 酵母系统成功合成的异源次级代谢产物 | 第32-33页 |
| 1.4 甲基营养型酵母——毕赤酵母 | 第33-40页 |
| 1.4.1 启动子P_(AOX1) | 第34-35页 |
| 1.4.2 启动子P_(GAP) | 第35页 |
| 1.4.3 其他可用的启动子 | 第35-36页 |
| 1.4.4 密码子优化与基因拷贝数 | 第36页 |
| 1.4.5 高密度培养 | 第36-37页 |
| 1.4.6 异源合成聚酮类化合物 | 第37-38页 |
| 1.4.7 乙酰辅酶A的代谢 | 第38-39页 |
| 1.4.8 合成生物学元件的应用 | 第39-40页 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 | 第40-41页 |
| 第2章 洛伐他汀异源合成途径的组装 | 第41-71页 |
| 2.1 前言 | 第41页 |
| 2.2 实验材料 | 第41-46页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第41-42页 |
| 2.2.2 培养基及培养条件 | 第42页 |
| 2.2.3 主要分子生物学试剂 | 第42-46页 |
| 2.3 实验方法 | 第46-51页 |
| 2.3.1 洛伐他汀生物合成相关基因的序列信息 | 第46-47页 |
| 2.3.2 洛伐他汀生物合成相关基因异源表达质粒的构建 | 第47-48页 |
| 2.3.3 感受态细胞的制备及电穿孔转化 | 第48-49页 |
| 2.3.4 重组转化子的基因型验证 | 第49页 |
| 2.3.5 摇瓶水平的甲醇诱导发酵 | 第49-50页 |
| 2.3.6 发酵产物的提取与检测 | 第50页 |
| 2.3.7 洛伐他汀及其中间产物的纯化制备 | 第50页 |
| 2.3.8 洛伐他汀及其中间产物的LC-MS和NMR鉴定 | 第50-51页 |
| 2.3.9 其他方法 | 第51页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第51-70页 |
| 2.4.1 表达质粒pZ-BCGN的构建 | 第51-52页 |
| 2.4.2 二氢莫纳可林L在毕赤酵母的异源合成 | 第52-53页 |
| 2.4.3 表达质粒pK-AR、pK-sAR的构建 | 第53-58页 |
| 2.4.4 莫纳可林J在毕赤酵母的异源合成 | 第58-61页 |
| 2.4.5 表达质粒pG-DF、pG-sDF的构建 | 第61-66页 |
| 2.4.6 洛伐他汀的异源合成 | 第66-70页 |
| 2.5 本章小结 | 第70-71页 |
| 第3章 洛伐他汀合成途径的表达优化与反应器发酵 | 第71-90页 |
| 3.1 前言 | 第71页 |
| 3.2 实验材料 | 第71-72页 |
| 3.3 实验方法 | 第72-75页 |
| 3.3.1 毕赤酵母高拷贝菌株的筛选 | 第72页 |
| 3.3.2 共培养菌株的构建 | 第72-73页 |
| 3.3.3 共培养菌株的摇瓶及反应器接种方法 | 第73页 |
| 3.3.4 毕赤酵母的5-L反应器发酵工艺控制 | 第73-75页 |
| 3.3.5 其他方法 | 第75页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第75-88页 |
| 3.4.1 优化异源基因剂量提升洛伐他汀合成 | 第75-78页 |
| 3.4.2 途径拆分结合共培养策略提升洛伐他汀合成 | 第78-80页 |
| 3.4.3 洛伐他汀高拷贝单菌株的5-L反应器发酵 | 第80-82页 |
| 3.4.4 共培养策略生产莫纳可林J的5-L反应器发酵 | 第82-86页 |
| 3.4.5 共培养策略生产洛伐他汀的反应器水平优化 | 第86-88页 |
| 3.5 本章小结 | 第88-90页 |
| 第4章 乙醇诱导型人工转录调控系统的开发 | 第90-106页 |
| 4.1 前言 | 第90页 |
| 4.2 实验材料 | 第90页 |
| 4.3 实验方法 | 第90-96页 |
| 4.3.1 生长的测定 | 第92-93页 |
| 4.3.2 缺失株△adh3、△ald、△acs1的获得 | 第93页 |
| 4.3.3 毕赤酵P_(AOX1)、P_(GAP)单拷贝表达eGFP菌株的获得 | 第93-94页 |
| 4.3.4 乙醇诱导型启动子表达eGFP菌株的获得 | 第94-95页 |
| 4.3.5 毕赤酵母人工转录调控系统表达eGFP菌株的获得 | 第95-96页 |
| 4.3.6 eGFP表达菌株荧光强度的测定 | 第96页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第96-104页 |
| 4.4.1 毕赤酵母在葡萄糖、甘油、甲醇中的代谢通路 | 第96-98页 |
| 4.4.2 在乙醇、乙酸中的生长 | 第98-99页 |
| 4.4.3 毕赤酵母中乙醇到乙酰辅酶A的代谢通路 | 第99-100页 |
| 4.4.4 乙醇诱导型人工转录系统的设计与构建 | 第100-101页 |
| 4.4.5 乙醇诱导型人工转录系统强度评价 | 第101-103页 |
| 4.4.6 人工转录系统在不同碳源浓度条件下的eGFP表达强度 | 第103-104页 |
| 4.5 本章小结 | 第104-106页 |
| 第5章 利用乙醇诱导型人工转录调控系统异源合成莫纳克林J | 第106-124页 |
| 5.1 前言 | 第106页 |
| 5.2 实验材料 | 第106页 |
| 5.3 实验方法 | 第106-115页 |
| 5.3.1 6-甲基水杨酸异源合成菌株的构建 | 第106-111页 |
| 5.3.2 人工转录系统合成二氢莫纳可林L菌株的构建 | 第111页 |
| 5.3.3 代谢工程改造提升二氢莫纳可林L合成的菌株构建 | 第111-113页 |
| 5.3.4 共培养生产莫纳可林J的菌株构建 | 第113-114页 |
| 5.3.5 乙醇为核心碳源的毕赤酵母摇瓶发酵方法 | 第114页 |
| 5.3.6 乙醇诱导系统异源合成化合物的提取、检测与定量 | 第114页 |
| 5.3.7 乙醇为核心碳源的5-L反应器发酵控制 | 第114-115页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第115-122页 |
| 5.4.1 各表达系统生产6-MSA产量的比较 | 第115-117页 |
| 5.4.2 应用乙醇诱导型人工转录调控系统合成二氢莫纳可林L | 第117-118页 |
| 5.4.3 代谢工程改造提升二氢莫纳可林L合成 | 第118-120页 |
| 5.4.4 基于乙醇诱导人工转录系统的多细胞共培养合成莫纳可林J | 第120-121页 |
| 5.4.5 乙醇为底物生产莫纳可林J的5-L反应器发酵 | 第121-122页 |
| 5.5 本章小结 | 第122-124页 |
| 第6章 结论、创新点与展望 | 第124-128页 |
| 6.1 主要结论 | 第124-126页 |
| 6.2 创新点 | 第126页 |
| 6.3 展望 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-139页 |
| 致谢 | 第139-140页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文与专利 | 第140页 |
