| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 主要英文缩略词对照表 | 第9-10页 |
| 第1章 引言 | 第10-19页 |
| 1.1 大片段DNA克隆概述 | 第10-13页 |
| 1.1.1 基于PCR的大片段DNA克隆方法 | 第11-12页 |
| 1.1.2 基于限制性核酸内切酶的大片段DNA克隆方法 | 第12-13页 |
| 1.2 CRISPR-Cas9酶切系统概述 | 第13-18页 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9酶切系统的组成与功能 | 第16-17页 |
| 1.2.2 基于CRISPR-Cas9系统的生物学工具 | 第17-18页 |
| 1.3 本文研究的主要内容及各章简介 | 第18-19页 |
| 第2章 实验材料 | 第19-28页 |
| 2.1 本章引论 | 第19页 |
| 2.2 微生物菌种 | 第19-20页 |
| 2.3 BAC载体及DNA引物 | 第20页 |
| 2.3.1 BAC载体元件组成及功能 | 第20页 |
| 2.3.2 DNA引物序列及订购信息 | 第20页 |
| 2.4 实验试剂 | 第20-26页 |
| 2.4.1 产品试剂 | 第20-25页 |
| 2.4.2 配置试剂 | 第25-26页 |
| 2.5 实验仪器及耗材 | 第26-28页 |
| 第3章 实验方法 | 第28-59页 |
| 3.1 本章引论 | 第28-29页 |
| 3.2 sgRNA的制备 | 第29-34页 |
| 3.2.1 sgRNA转录模板DNA的制备 | 第30-33页 |
| 3.2.2 体外转录及纯化 | 第33-34页 |
| 3.3 基因组DNA琼脂糖胶块的制备 | 第34-37页 |
| 3.3.1 大肠杆菌等细菌基因组DNA琼脂糖胶块的制备 | 第35-36页 |
| 3.3.2 酵母基因组DNA琼脂糖胶块的制备 | 第36-37页 |
| 3.4 Cas9胶中酶切及脉冲场电泳检测 | 第37-41页 |
| 3.4.1 Cas9胶中酶切 | 第38-39页 |
| 3.4.2 脉冲场电泳检测 | 第39-41页 |
| 3.5 BAC克隆载体的扩增及纯化 | 第41-46页 |
| 3.6 Gibson Assembly连接反应及电击转化 | 第46-50页 |
| 3.7 阳性克隆的鉴定 | 第50-56页 |
| 3.7.1 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第50-52页 |
| 3.7.2 BAC质粒提取 | 第52-54页 |
| 3.7.3 BAC质粒线性化及脉冲场电泳检测 | 第54-56页 |
| 3.8 大肠杆菌电转感受态细胞的培养及制备 | 第56-59页 |
| 3.8.1 大肠杆菌电转感受态细胞的培养 | 第56-57页 |
| 3.8.2 大肠杆菌电转感受态细胞的制备 | 第57-59页 |
| 第4章 应用CATCH技术酶切及分离基因组大片段DNA | 第59-78页 |
| 4.1 本章引论 | 第59页 |
| 4.2 CATCH酶切体系的优化 | 第59-63页 |
| 4.3 大肠杆菌中不同长度目标大片段DNA的酶切 | 第63-66页 |
| 4.4 sgRNA在基因组上结合位置对酶切反应的影响 | 第66-70页 |
| 4.5 应用CATCH技术酶切不同微生物基因组上的目标片段 | 第70-77页 |
| 4.5.1 应用CATCH技术酶切天蓝色链霉菌基因组 | 第70-73页 |
| 4.5.2 应用CATCH技术酶切酿酒酵母基因组 | 第73-77页 |
| 4.6 本章小结 | 第77-78页 |
| 第5章 应用CATCH技术克隆基因组大片段DNA | 第78-102页 |
| 5.1 本章引论 | 第78页 |
| 5.2 目标片段长度对CATCH靶向克隆效率的影响 | 第78-84页 |
| 5.3 sgRNA设计方向对CATCH靶向克隆效率的影响 | 第84-90页 |
| 5.4 sgRNA在基因组上结合位置对CATCH靶向克隆效率的影响 | 第90-94页 |
| 5.5 阴性克隆序列分析 | 第94-95页 |
| 5.6 应用CATCH技术靶向克隆微生物中长基因簇 | 第95-101页 |
| 5.7 本章小结 | 第101-102页 |
| 第6章 总结与展望 | 第102-111页 |
| 6.1 本章引论 | 第102页 |
| 6.2 CATCH技术的优势 | 第102-104页 |
| 6.3 CATCH技术的应用前景 | 第104-106页 |
| 6.4 CATCH技术的局限 | 第106-107页 |
| 6.5 优化CATCH技术的方向 | 第107-111页 |
| 6.5.1 优化sgRNA设计位点及序列 | 第108-109页 |
| 6.5.2 Cas9蛋白的高保真突变体 | 第109页 |
| 6.5.3 其它CRISPR-Cas系统的体外应用 | 第109-111页 |
| 第7章 其它研究工作 | 第111-113页 |
| 7.1 大气微生物宏基因组学研究背景 | 第111-112页 |
| 7.2 大气微生物宏基因组学研究方法简介 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-118页 |
| 致谢 | 第118-120页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第120页 |
