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金黄色葡萄球菌激活中性粒细胞致血管渗漏机制研究

缩略语表第7-9页
摘要第9-12页
Abstract第12-14页
前言第15-23页
    1.立题依据第15-20页
        1.1 金葡菌感染与血管渗漏概况第15-16页
        1.2 金葡菌毒力因子引起血管渗漏机制研究第16-18页
        1.3 HBP与脓毒症和血管渗漏的关系第18-19页
        1.4 金葡菌感染与HBP第19-20页
    2.研究思路、研究方法、拟解决的科学问题第20-22页
        2.1 研究思路第20页
        2.2 研究方法第20-21页
        2.3 技术路线第21页
        2.4 拟解决的科学问题第21-22页
    3.本研究的特色和创新之处第22-23页
第一部分:金葡菌感染与HBP水平的变化第23-29页
    1. 引言第23页
    2. 材料与方法第23-26页
        2.1 材料第23-25页
            2.1.1 菌株第23-24页
            2.1.2 主要试剂第24-25页
            2.1.3 主要仪器第25页
        2.2 主要实验方法第25-26页
            2.2.1 双抗夹心酶联免疫法检测病人血清中HBP含量第25-26页
            2.2.2 双抗夹心酶联免疫法检测CA-MRSA和HA-MRSA上清刺激HBP生成第26页
    3. 实验结果第26-28页
        3.1 金葡菌感染患者与健康人血清中HBP含量检测第26页
        3.2 金葡菌不同临床菌株刺激HBP生成能力验证第26-27页
        3.3 金葡菌上清与已报道刺激物刺激HBP能力对比第27-28页
    4.小结与讨论第28-29页
第二部分:金葡菌上清中HBP释放刺激源分离鉴定第29-48页
    1.引言第29页
    2.材料与方法第29-37页
        2.1 材料第29-33页
            2.1.1 菌株、质粒及引物第29-30页
            2.1.2 主要试剂及配方第30-32页
            2.1.3 主要仪器第32-33页
        2.2 主要实验方法第33-37页
            2.2.1 金葡菌上清蛋白超滤分离第33页
            2.2.2 金葡菌上清蛋白的收集第33-34页
            2.2.3 离子交换柱纯化分离上清蛋白第34页
            2.2.4 上清蛋白中多肽混合物粗提第34页
            2.2.5 金葡菌感受态制备第34页
            2.2.6 金葡菌PSMα1-4 基因以及PSMα4 基因互补菌株构建第34-36页
            2.2.7 金葡菌PSMα1-4 基因以及PSMα4 回复菌株表达鉴定第36页
            2.2.8 PSMα4 的兔血清多克隆抗体纯化第36-37页
    3.主要实验结果第37-46页
        3.1 上清中刺激源性质的确定第37-38页
        3.2 金葡菌上清中已知毒力因子对HBP释放的作用第38-39页
        3.3 上清中未知HBP刺激源的分离鉴定第39-42页
        3.4 上清中刺激源的体外刺激能力验证第42-46页
            3.4.1 体外合成多肽检测只有PSMα4 可以刺激HBP生成第42页
            3.4.2 PSMα1-4 与PSMα4 基因互补质粒构建第42-44页
            3.4.3 野生株、敲除株、互补株上清验证PSMα4 的功能第44-45页
            3.4.4 转录及翻译水平验证CA-MRSA中PSMα4 表达量高于HA-MRSA第45-46页
    4.小结与讨论第46-48页
第三部分:金葡菌上清刺激HBP释放机制及介导血管渗漏的初步探究第48-79页
    1.引言第48-49页
    2.材料与方法第49-60页
        2.1 材料第49-51页
            2.1.1 菌株与细胞株第49页
            2.1.2 主要试剂第49-51页
            2.1.3 主要仪器第51页
            2.1.4 实验动物第51页
        2.2 实验方法第51-60页
            2.2.1 从人全血中分离中性粒细胞第51-52页
            2.2.2 Western Blot检测样品中的HBP第52页
            2.2.3 PSMα1- PSMα4在有无血清脂蛋白作用下对中性粒细胞的LDH检测第52-53页
            2.2.4 激光共聚焦显微镜检测PSMα4引起的中性粒细胞Ca2+内流第53页
            2.2.5 流式检测PSMα4引起的中性粒细胞脱颗粒第53页
            2.2.6 激光共聚焦检测PSMα4引起的中性粒细胞脱颗粒过程第53-54页
            2.2.7 流式检测在PSMα4引起的中性粒细胞内活性氧离子的产生第54页
            2.2.8 ELISA检测PSMα4与人全血以及小鼠中性粒细胞作用后上清中MPO、Elastase、TNF-α、IL-8、IFN-γ 等细胞因子的释放第54-55页
            2.2.9 Transwell模型检测PSMα4与中性粒细胞的相关作用对内皮屏障的影响第55-56页
            2.2.10 Miles assay评价野生株、敲除株和互补株上清引起的小鼠皮肤血管渗漏第56页
            2.2.11 Miles assay验证PSMα4以及其受体抑制剂WRW4在小鼠皮肤血管渗漏模型中的作用第56页
            2.2.12 中性粒细胞减少症(neutropenic)小鼠模型建立第56-57页
            2.2.13 野生株、敲除株表达上清在中性粒细胞减少症小鼠模型中的研究第57页
            2.2.14 合成多肽PSMα4在中性粒细胞减少症小鼠模型中的研究第57页
            2.2.15 小鼠全血中性粒细胞分离第57-58页
            2.2.16 PSMα4与小鼠中性粒细胞作用后上清在neutropenic小鼠模型中的研究第58页
            2.2.17 丙氨酸突变法推测与PSMα4功能相关的关键氨基酸第58页
            2.2.18 金葡菌USA300野生株和PSMα 敲除菌株在小鼠肺部血管渗漏模型中的毒力差异的验证第58-60页
    3.实验结果第60-77页
        3.1 PSMα4 的功能不受血浆高密度脂蛋白的影响第60-61页
        3.2 PSMα4 可以激活中性粒细胞初级颗粒的释放第61-62页
        3.3 PSMα4 通过PMN上的FPR-2 受体激活PI3K信号通路引起HBP释放第62-64页
        3.4 PSMα4 刺激HBP释放的过程有钙离子内流以及细胞骨架重排第64-65页
        3.5 PSMα4 刺激HBP释放可以增加HUVEC单层细胞的通透性第65-66页
        3.6 影响HUVEC单层细胞的通透性改变的其它作用因子评价第66-68页
        3.7 丙氨酸扫描定点突变筛选PSMα4 刺激释放HBP的关键氨基酸第68页
        3.8 Miles assay验证金葡菌野生株、敲除株以及互补株造成血管渗漏的差异第68-69页
        3.9 Miles assay实验验证PSMα4 引起血管渗漏以及抑制剂的效果第69-70页
        3.10 PSMα4 与小鼠中性粒细胞作用后上清中检测到脱颗粒产物第70-71页
        3.11 PSMα4 与小鼠中性粒细胞作用后上清中没有检测到细胞因子释放第71页
        3.12 Neutropenic小鼠模型成功构建第71-73页
        3.13 金葡菌野生型培养上清不会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏第73-74页
        3.14 PSMα4 不会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏第74-75页
        3.15 PSMα4 与PMN作用后的上清会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏第75-76页
        3.16 金葡菌菌血症感染模型中小鼠肺组织有渗漏现象第76-77页
    4.小结与讨论第77-79页
结论第79-80页
参考文献第80-91页
个人简历第91-93页
致谢第93页

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