缩略语表 | 第7-9页 |
摘要 | 第9-12页 |
Abstract | 第12-14页 |
前言 | 第15-23页 |
1.立题依据 | 第15-20页 |
1.1 金葡菌感染与血管渗漏概况 | 第15-16页 |
1.2 金葡菌毒力因子引起血管渗漏机制研究 | 第16-18页 |
1.3 HBP与脓毒症和血管渗漏的关系 | 第18-19页 |
1.4 金葡菌感染与HBP | 第19-20页 |
2.研究思路、研究方法、拟解决的科学问题 | 第20-22页 |
2.1 研究思路 | 第20页 |
2.2 研究方法 | 第20-21页 |
2.3 技术路线 | 第21页 |
2.4 拟解决的科学问题 | 第21-22页 |
3.本研究的特色和创新之处 | 第22-23页 |
第一部分:金葡菌感染与HBP水平的变化 | 第23-29页 |
1. 引言 | 第23页 |
2. 材料与方法 | 第23-26页 |
2.1 材料 | 第23-25页 |
2.1.1 菌株 | 第23-24页 |
2.1.2 主要试剂 | 第24-25页 |
2.1.3 主要仪器 | 第25页 |
2.2 主要实验方法 | 第25-26页 |
2.2.1 双抗夹心酶联免疫法检测病人血清中HBP含量 | 第25-26页 |
2.2.2 双抗夹心酶联免疫法检测CA-MRSA和HA-MRSA上清刺激HBP生成 | 第26页 |
3. 实验结果 | 第26-28页 |
3.1 金葡菌感染患者与健康人血清中HBP含量检测 | 第26页 |
3.2 金葡菌不同临床菌株刺激HBP生成能力验证 | 第26-27页 |
3.3 金葡菌上清与已报道刺激物刺激HBP能力对比 | 第27-28页 |
4.小结与讨论 | 第28-29页 |
第二部分:金葡菌上清中HBP释放刺激源分离鉴定 | 第29-48页 |
1.引言 | 第29页 |
2.材料与方法 | 第29-37页 |
2.1 材料 | 第29-33页 |
2.1.1 菌株、质粒及引物 | 第29-30页 |
2.1.2 主要试剂及配方 | 第30-32页 |
2.1.3 主要仪器 | 第32-33页 |
2.2 主要实验方法 | 第33-37页 |
2.2.1 金葡菌上清蛋白超滤分离 | 第33页 |
2.2.2 金葡菌上清蛋白的收集 | 第33-34页 |
2.2.3 离子交换柱纯化分离上清蛋白 | 第34页 |
2.2.4 上清蛋白中多肽混合物粗提 | 第34页 |
2.2.5 金葡菌感受态制备 | 第34页 |
2.2.6 金葡菌PSMα1-4 基因以及PSMα4 基因互补菌株构建 | 第34-36页 |
2.2.7 金葡菌PSMα1-4 基因以及PSMα4 回复菌株表达鉴定 | 第36页 |
2.2.8 PSMα4 的兔血清多克隆抗体纯化 | 第36-37页 |
3.主要实验结果 | 第37-46页 |
3.1 上清中刺激源性质的确定 | 第37-38页 |
3.2 金葡菌上清中已知毒力因子对HBP释放的作用 | 第38-39页 |
3.3 上清中未知HBP刺激源的分离鉴定 | 第39-42页 |
3.4 上清中刺激源的体外刺激能力验证 | 第42-46页 |
3.4.1 体外合成多肽检测只有PSMα4 可以刺激HBP生成 | 第42页 |
3.4.2 PSMα1-4 与PSMα4 基因互补质粒构建 | 第42-44页 |
3.4.3 野生株、敲除株、互补株上清验证PSMα4 的功能 | 第44-45页 |
3.4.4 转录及翻译水平验证CA-MRSA中PSMα4 表达量高于HA-MRSA | 第45-46页 |
4.小结与讨论 | 第46-48页 |
第三部分:金葡菌上清刺激HBP释放机制及介导血管渗漏的初步探究 | 第48-79页 |
1.引言 | 第48-49页 |
2.材料与方法 | 第49-60页 |
2.1 材料 | 第49-51页 |
2.1.1 菌株与细胞株 | 第49页 |
2.1.2 主要试剂 | 第49-51页 |
2.1.3 主要仪器 | 第51页 |
2.1.4 实验动物 | 第51页 |
2.2 实验方法 | 第51-60页 |
2.2.1 从人全血中分离中性粒细胞 | 第51-52页 |
2.2.2 Western Blot检测样品中的HBP | 第52页 |
2.2.3 PSMα1- PSMα4在有无血清脂蛋白作用下对中性粒细胞的LDH检测 | 第52-53页 |
2.2.4 激光共聚焦显微镜检测PSMα4引起的中性粒细胞Ca2+内流 | 第53页 |
2.2.5 流式检测PSMα4引起的中性粒细胞脱颗粒 | 第53页 |
2.2.6 激光共聚焦检测PSMα4引起的中性粒细胞脱颗粒过程 | 第53-54页 |
2.2.7 流式检测在PSMα4引起的中性粒细胞内活性氧离子的产生 | 第54页 |
2.2.8 ELISA检测PSMα4与人全血以及小鼠中性粒细胞作用后上清中MPO、Elastase、TNF-α、IL-8、IFN-γ 等细胞因子的释放 | 第54-55页 |
2.2.9 Transwell模型检测PSMα4与中性粒细胞的相关作用对内皮屏障的影响 | 第55-56页 |
2.2.10 Miles assay评价野生株、敲除株和互补株上清引起的小鼠皮肤血管渗漏 | 第56页 |
2.2.11 Miles assay验证PSMα4以及其受体抑制剂WRW4在小鼠皮肤血管渗漏模型中的作用 | 第56页 |
2.2.12 中性粒细胞减少症(neutropenic)小鼠模型建立 | 第56-57页 |
2.2.13 野生株、敲除株表达上清在中性粒细胞减少症小鼠模型中的研究 | 第57页 |
2.2.14 合成多肽PSMα4在中性粒细胞减少症小鼠模型中的研究 | 第57页 |
2.2.15 小鼠全血中性粒细胞分离 | 第57-58页 |
2.2.16 PSMα4与小鼠中性粒细胞作用后上清在neutropenic小鼠模型中的研究 | 第58页 |
2.2.17 丙氨酸突变法推测与PSMα4功能相关的关键氨基酸 | 第58页 |
2.2.18 金葡菌USA300野生株和PSMα 敲除菌株在小鼠肺部血管渗漏模型中的毒力差异的验证 | 第58-60页 |
3.实验结果 | 第60-77页 |
3.1 PSMα4 的功能不受血浆高密度脂蛋白的影响 | 第60-61页 |
3.2 PSMα4 可以激活中性粒细胞初级颗粒的释放 | 第61-62页 |
3.3 PSMα4 通过PMN上的FPR-2 受体激活PI3K信号通路引起HBP释放 | 第62-64页 |
3.4 PSMα4 刺激HBP释放的过程有钙离子内流以及细胞骨架重排 | 第64-65页 |
3.5 PSMα4 刺激HBP释放可以增加HUVEC单层细胞的通透性 | 第65-66页 |
3.6 影响HUVEC单层细胞的通透性改变的其它作用因子评价 | 第66-68页 |
3.7 丙氨酸扫描定点突变筛选PSMα4 刺激释放HBP的关键氨基酸 | 第68页 |
3.8 Miles assay验证金葡菌野生株、敲除株以及互补株造成血管渗漏的差异 | 第68-69页 |
3.9 Miles assay实验验证PSMα4 引起血管渗漏以及抑制剂的效果 | 第69-70页 |
3.10 PSMα4 与小鼠中性粒细胞作用后上清中检测到脱颗粒产物 | 第70-71页 |
3.11 PSMα4 与小鼠中性粒细胞作用后上清中没有检测到细胞因子释放 | 第71页 |
3.12 Neutropenic小鼠模型成功构建 | 第71-73页 |
3.13 金葡菌野生型培养上清不会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏 | 第73-74页 |
3.14 PSMα4 不会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏 | 第74-75页 |
3.15 PSMα4 与PMN作用后的上清会在neutropenic小鼠模型中引起血管渗漏 | 第75-76页 |
3.16 金葡菌菌血症感染模型中小鼠肺组织有渗漏现象 | 第76-77页 |
4.小结与讨论 | 第77-79页 |
结论 | 第79-80页 |
参考文献 | 第80-91页 |
个人简历 | 第91-93页 |
致谢 | 第93页 |