| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 缩略词表 | 第13-15页 |
| 第一部分 实验研究 | 第15-58页 |
| 第一章 sgRNA载体及打靶载体的构建 | 第15-31页 |
| 1 材料 | 第16页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第16页 |
| 1.2 活体材料 | 第16页 |
| 1.3 菌种与载体 | 第16页 |
| 1.4 主要实验材料、试剂与耗材 | 第16页 |
| 2 方法 | 第16-21页 |
| 2.1 sgRNA载体的构建 | 第16-18页 |
| 2.2 打靶载体的构建 | 第18-21页 |
| 2.2.1 克隆Csnk1ε基因cDNA序列 | 第18-19页 |
| 2.2.2 克隆人源K14启动子序列及其启动的红荧光表达载体的构建 | 第19页 |
| 2.2.2.1 克隆人源K14启动子序列 | 第19页 |
| 2.2.2.2 人源K14启动子启动红荧光表达载体的构建 | 第19页 |
| 2.2.3 克隆打靶载体的上、下游同源臂 | 第19-20页 |
| 2.2.4 打靶载体的组装 | 第20-21页 |
| 2.2.4.1 Csnk1ε基因与pMP载体的连接 | 第20页 |
| 2.2.4.2 人源K14启动子与pMCP载体的连接 | 第20页 |
| 2.2.4.3 上下游同源臂与pMKCP载体的连接 | 第20-21页 |
| 3 结果 | 第21-28页 |
| 3.1 sgRNA载体的构建 | 第21页 |
| 3.2 Csnkls基因cDNA序列的分析与鉴定 | 第21-22页 |
| 3.3 人源K14启动子序列的分析鉴定以及其启动红荧光载体的构建 | 第22-24页 |
| 3.3.1 人源K14启动子序列的分析鉴定 | 第22-23页 |
| 3.3.2 人源K14启动子启动红荧光载体的构建 | 第23-24页 |
| 3.4 上、下游同源臂序列的分析鉴定 | 第24-25页 |
| 3.5 构建打靶载体的酶切鉴定 | 第25-28页 |
| 3.5.1 Csnk1ε基因与pMP载体连接的酶切鉴定 | 第25-26页 |
| 3.5.2 人源K14启动子与pMCP载体连接的酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 3.5.3 上下游同源臂与pMKCP载体连接酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 3.5.4 打靶载体pMLKCPR的酶切鉴定 | 第28页 |
| 4 讨论 | 第28-29页 |
| 参考文献 | 第29-31页 |
| 第二章 细胞水平上的相关检测 | 第31-41页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第31页 |
| 1.2 活体材料 | 第31-32页 |
| 1.3 菌种与载体 | 第32页 |
| 1.4 主要实验材料、试剂与耗材 | 第32页 |
| 2 方法 | 第32-35页 |
| 2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第32页 |
| 2.2 小鼠胎儿成纤维细胞电转条件的优化 | 第32-33页 |
| 2.3 靶位点的筛选鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.1 sgRNA载体与Cas9质粒共转染MEF | 第33页 |
| 2.3.2 靶位点的筛选及切除效率检测 | 第33-34页 |
| 2.4 打靶载体中人源K14启动子启动功能的检测 | 第34页 |
| 2.5 打靶载体同源重组的检测 | 第34-35页 |
| 2.5.1 检测引物的设计 | 第34-35页 |
| 2.5.2 打靶载体同源重组的检测 | 第35页 |
| 3 结果 | 第35-39页 |
| 3.1 小鼠胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第35-36页 |
| 3.2 MEF电转条件的优化 | 第36页 |
| 3.3 靶位点的筛选及切除效率检测 | 第36-37页 |
| 3.4 人源K14启动子启动功能的检测 | 第37-38页 |
| 3.5 打靶载体同源重组的检测 | 第38-39页 |
| 4 讨论 | 第39页 |
| 参考文献 | 第39-41页 |
| 第三章 转基因小鼠的制备 | 第41-50页 |
| 1 材料 | 第41-42页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第41页 |
| 1.2 活体材料 | 第41页 |
| 1.3 外源基因 | 第41-42页 |
| 1.4 主要试剂 | 第42页 |
| 2 方法 | 第42-45页 |
| 2.1 注射基因的准备 | 第42页 |
| 2.1.1 pMLKCPR质粒线性化 | 第42页 |
| 2.1.2 sgRNA载体和Cas9质粒的准备 | 第42页 |
| 2.1.3 注射基因的纯化 | 第42页 |
| 2.2 实验用鼠的准备 | 第42-43页 |
| 2.3 受精卵的获得 | 第43页 |
| 2.4 原核注射 | 第43页 |
| 2.5 胚胎移植 | 第43页 |
| 2.6 转基因鼠PCR反应鉴定 | 第43-44页 |
| 2.7 转基因鼠的Southern blot鉴定 | 第44-45页 |
| 2.7.1 采用PCR法制备探针 | 第44页 |
| 2.7.2 地高辛标记DNA的效率检测 | 第44页 |
| 2.7.3 基因组DNA的酶切和电泳 | 第44-45页 |
| 2.7.4 DNA的转移、固定及探针杂交 | 第45页 |
| 2.7.5 洗膜和免疫检测 | 第45页 |
| 2.8 转基因阳性鼠的传代 | 第45页 |
| 3 结果 | 第45-47页 |
| 3.1 转基因阳性鼠PCR的鉴定结果 | 第45-46页 |
| 3.2 转基因阳性鼠Southern blot的鉴定结果 | 第46-47页 |
| 3.2.1 探针标记的效率结果 | 第46页 |
| 3.2.2 Southern blot杂交结果 | 第46-47页 |
| 3.3 转基因阳性小鼠传代的结果 | 第47页 |
| 4 讨论 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-50页 |
| 第四章 Csnk1ε转基因阳性小鼠表达水平的检测 | 第50-57页 |
| 1 材料 | 第50-51页 |
| 1.1 主要仪器设备 | 第50页 |
| 1.2 活体材料 | 第50页 |
| 1.3 主要实验材料、试剂与耗材 | 第50-51页 |
| 1.4 试剂配制 | 第51页 |
| 2 方法 | 第51-53页 |
| 2.1 实时定量PCR | 第51-52页 |
| 2.1.1 总RNA的提取 | 第51页 |
| 2.1.2 RT-PCR | 第51页 |
| 2.1.3 实时定量PCR | 第51-52页 |
| 2.1.4 Csnk1ε基因mRNA水平相对表达量的计算 | 第52页 |
| 2.2 蛋白印迹法(Western Blot)检测 | 第52-53页 |
| 2.2.1 蛋白质的提取 | 第52页 |
| 2.2.2 Western Blot | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-54页 |
| 3.1 实时定量PCR的结果 | 第53页 |
| 3.2 蛋白印迹法(Western Blot)检测结果 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 结论 | 第57-58页 |
| 第二部分 文献综述 CRISPR/Cas系统概述 | 第58-64页 |
| 1、CRISPR/Cas系统的基本结构 | 第58-59页 |
| 2、CRISPR/Cas系统的作用机制 | 第59页 |
| 3、CRISPR/Cas系统的构建方法与突变效率检测 | 第59-60页 |
| 4、CRISPR/Cas系统的脱靶效应和问题 | 第60页 |
| 5、结语 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-64页 |
| 图版1 | 第64-65页 |
| 附录 | 第65-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
