| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 第一章 绪论 | 第17-28页 |
| 1.1 引言 | 第17页 |
| 1.2 γ-氨基丁酸的化学结构和理化性质 | 第17-18页 |
| 1.3 γ-氨基丁酸的分布 | 第18页 |
| 1.4 γ-氨基丁酸的生理功能 | 第18-19页 |
| 1.5 γ-氨基丁酸的应用 | 第19-20页 |
| 1.5.1 γ-氨基丁酸在食品中的应用 | 第19-20页 |
| 1.5.2 γ-氨基丁酸在医药行业中的应用 | 第20页 |
| 1.5.3 γ-氨基丁酸在畜牧业行业中的应用 | 第20页 |
| 1.6 γ-氨基丁酸的制备方法 | 第20-21页 |
| 1.6.1 化学合成法 | 第20-21页 |
| 1.6.2 植物富集法 | 第21页 |
| 1.6.3 微生物发酵法 | 第21页 |
| 1.7 γ-氨基丁酸的检测方法 | 第21-23页 |
| 1.8 γ-氨基丁酸的代谢途径 | 第23-24页 |
| 1.9 谷氨酸脱羧酶(GAD)简介 | 第24-26页 |
| 1.9.1 动物GAD | 第24-25页 |
| 1.9.2 植物中的GAD | 第25页 |
| 1.9.3 细菌体内的GAD | 第25-26页 |
| 1.10 γ-氨基丁酸代谢途径中其他相关酶简介 | 第26页 |
| 1.11 本论文的研究目的和意义 | 第26页 |
| 1.12 本论文研究思路和内容 | 第26-28页 |
| 第二章 基因敲除菌株的构建 | 第28-40页 |
| 2.1 前言 | 第28-29页 |
| 2.2 实验材料 | 第29-35页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第29页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第29页 |
| 2.2.3 培养基和试剂配制 | 第29-30页 |
| 2.2.4 主要仪器 | 第30-31页 |
| 2.2.5 基因敲除所用引物 | 第31-32页 |
| 2.2.6 分子生物学实验操作 | 第32-35页 |
| 2.2.6.1 凝胶电泳 | 第32页 |
| 2.2.6.2 质粒提取试剂盒使用 | 第32页 |
| 2.2.6.3 目的片段的扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.6.4 大肠杆菌感受态的制备与转化 | 第33-35页 |
| 2.3 基因敲除流程 | 第35-36页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第36-39页 |
| 2.4.1 gabT基因敲除结果 | 第36-37页 |
| 2.4.2 gabP基因敲除结果 | 第37-38页 |
| 2.4.3 puuE基因敲除结果 | 第38-39页 |
| 2.5 本章结论 | 第39-40页 |
| 第三章 重组表达质粒的构建 | 第40-50页 |
| 3.1 前言 | 第40-41页 |
| 3.2 实验材料 | 第41-44页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第41页 |
| 3.2.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 3.2.3 培养基和试剂配制 | 第42页 |
| 3.2.4 主要仪器 | 第42页 |
| 3.2.5 重组质粒实验中所用引物 | 第42-43页 |
| 3.2.6 分子生物学实验操作 | 第43-44页 |
| 3.2.6.1 凝胶电泳 | 第43页 |
| 3.2.6.2 质粒提取试剂盒使用 | 第43页 |
| 3.2.6.3 目的片段的扩增 | 第43页 |
| 3.2.6.4 琼脂糖凝胶中DNA的割胶回收 | 第43-44页 |
| 3.2.6.5 热激感受态细胞制备及质粒转化 | 第44页 |
| 3.3 重组质粒的构建 | 第44-45页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第45-49页 |
| 3.4.1 质粒大小鉴定 | 第45-46页 |
| 3.4.2 PCR鉴定和双酶切鉴定 | 第46-47页 |
| 3.4.3 测序鉴定 | 第47-49页 |
| 3.5 本章结论 | 第49-50页 |
| 第四章 重组菌株的构建和研究 | 第50-61页 |
| 4.1 前言 | 第50页 |
| 4.2 实验材料 | 第50-52页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第50页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第50-51页 |
| 4.2.3 培养基和试剂配制 | 第51页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第51-52页 |
| 4.3 重组表达菌株的构建 | 第52页 |
| 4.4 目的蛋白的表达与SDS-PAGE分析 | 第52-54页 |
| 4.4.1 目的蛋白的诱导表达 | 第52页 |
| 4.4.2 细胞破碎 | 第52-53页 |
| 4.4.3 蛋白电泳凝胶的制备 | 第53页 |
| 4.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第53页 |
| 4.4.5 蛋白电泳结果分析 | 第53-54页 |
| 4.5 重组菌株合成GABA能力初始研究 | 第54-60页 |
| 4.5.1 摇床发酵 | 第54-55页 |
| 4.5.2 GABA浓度的测定 | 第55-60页 |
| 4.5.2.1 高效液相色谱法测定 | 第55页 |
| 4.5.2.2 标曲制作 | 第55-58页 |
| 4.5.2.3 发酵液中GABA浓度的测定 | 第58-60页 |
| 4.6 本章结论 | 第60-61页 |
| 第五章 GABA摇瓶发酵优化 | 第61-83页 |
| 5.1 前言 | 第61页 |
| 5.2 实验材料 | 第61-62页 |
| 5.2.1 菌株 | 第61页 |
| 5.2.2 主要试剂 | 第61-62页 |
| 5.2.3 培养基和试剂配制 | 第62页 |
| 5.2.4 主要仪器 | 第62页 |
| 5.3 实验方法 | 第62-66页 |
| 5.3.1 重组菌株摇瓶发酵生产GABA | 第62-63页 |
| 5.3.2 GABA的检测方法 | 第63页 |
| 5.3.3 重组菌株发酵生产GABA的培养基优化 | 第63-64页 |
| 5.3.3.1 碳源及其添加量的优化 | 第63页 |
| 5.3.3.2 氮源及其添加量的优化 | 第63-64页 |
| 5.3.3.3 底物浓度的优化 | 第64页 |
| 5.3.3.4 无机盐的添加及浓度优化 | 第64页 |
| 5.3.4 重组菌株发酵生产GABA的培养条件优化 | 第64-65页 |
| 5.3.4.1 装液量的优化 | 第64页 |
| 5.3.4.2 诱导剂浓度的优化 | 第64页 |
| 5.3.4.3 调整pH时机的优化 | 第64页 |
| 5.3.4.4 接种量的优化 | 第64页 |
| 5.3.4.5 诱导培养时pH值的优化 | 第64-65页 |
| 5.3.5 响应面的优化 | 第65-66页 |
| 5.3.5.1 Plackett-Burman试验设计 | 第65页 |
| 5.3.5.2 Box-Behnken试验设计 | 第65页 |
| 5.3.5.3 最佳浓度的确定及验证实验 | 第65-66页 |
| 5.3.6 发酵过程实时监测 | 第66页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第66-82页 |
| 5.4.1 重组菌株发酵生产GABA的培养基优化 | 第66-72页 |
| 5.4.1.1 碳源的优化 | 第66-67页 |
| 5.4.1.2 氮源的优化 | 第67-70页 |
| 5.4.1.3 底物浓度的优化 | 第70-71页 |
| 5.4.1.4 无机盐的添加及浓度优化 | 第71-72页 |
| 5.4.2 重组菌株发酵生产GABA的培养条件的优化 | 第72-75页 |
| 5.4.2.1 装液量的优化 | 第72-73页 |
| 5.4.2.2 诱导剂浓度的优化 | 第73页 |
| 5.4.2.3 盐酸调节pH的时间的优化 | 第73-74页 |
| 5.4.2.4 接种量的优化 | 第74-75页 |
| 5.4.2.5 诱导培养时pH的优化 | 第75页 |
| 5.4.3 响应面优化 | 第75-81页 |
| 5.4.3.1 PB试验结果 | 第75-76页 |
| 5.4.3.2 Box-Behnken试验结果 | 第76-79页 |
| 5.4.3.3 确定最佳浓度及验证实验 | 第79-81页 |
| 5.4.4 发酵过程实时监测 | 第81-82页 |
| 5.5 本章结论 | 第82-83页 |
| 第六章 结论 | 第83-86页 |
| 6.1 课题总结 | 第83页 |
| 6.2 讨论 | 第83-85页 |
| 6.3 展望 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
