| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-16页 |
| 1 引言 | 第16-30页 |
| ·蛋白质的动态结构和功能 | 第16-17页 |
| ·蛋白质的核磁共振研究 | 第17-22页 |
| ·核磁共振基本原理 | 第17-19页 |
| ·化学位移 | 第19页 |
| ·弛豫时间 | 第19-20页 |
| ·核磁共振蛋白质样品的制备 | 第20-22页 |
| ·顺磁弛豫增强技术 | 第22-30页 |
| ·顺磁弛豫增强原理 | 第22-23页 |
| ·顺磁弛豫增强速率的测定 | 第23-25页 |
| ·顺磁探针的定点标记 | 第25-27页 |
| ·顺磁弛豫增强用于蛋白质动态结构和功能的研究 | 第27-30页 |
| 2 泛素动态结构和功能的研究 | 第30-72页 |
| ·引言 | 第30-32页 |
| ·材料和方法 | 第32-39页 |
| ·样品制备 | 第32-38页 |
| ·蛋白质氨基酸序列 | 第32-34页 |
| ·人源泛素(Ub) | 第32页 |
| ·人源E1 | 第32-33页 |
| ·酵母E2(ScUbcl3/ScMms2复合体) | 第33页 |
| ·TEV | 第33页 |
| ·人源NZF结构域 | 第33页 |
| ·人源tUIM | 第33-34页 |
| ·样品制备buffer | 第34页 |
| ·蛋白质的表达与纯化 | 第34-38页 |
| ·Ub的表达和纯化 | 第35页 |
| ·E1的表达和纯化 | 第35页 |
| ·E2的表达和纯化 | 第35页 |
| ·K63-diUb的制备 | 第35-36页 |
| ·TEV的表达和纯化 | 第36页 |
| ·NZF的表达和纯化 | 第36页 |
| ·tUIM的表达和纯化 | 第36-37页 |
| ·顺磁标记的样品制备 | 第37-38页 |
| ·Ub的分析型超速离心实验 | 第38页 |
| ·Ub的浓度稀释滴定实验 | 第38页 |
| ·Ub不同浓度下的运动相关时间τ_c的测定 | 第38页 |
| ·Ub分子间的顺磁弛豫增强速率测定 | 第38-39页 |
| ·K63-diUb的顺磁弛豫增强速率测定 | 第39页 |
| ·K63-diUb闭合态系综结构的主成份分析 | 第39页 |
| ·K63-diUb与靶蛋白的等温滴定量热实验 | 第39页 |
| ·结果 | 第39-62页 |
| ·Ub的分析型超速离心结果 | 第39-40页 |
| ·Ub不同浓度下的化学位移以及运动相关时间τ_c的变化 | 第40-42页 |
| ·Ub分子间的PRE与二聚体的系综结构 | 第42-47页 |
| ·K63-diUb分子间和分子内的PRE | 第47-50页 |
| ·K63-diUb闭合态的结构计算 | 第50-54页 |
| ·K63-diUb闭合态的系综结构 | 第54-59页 |
| ·K63-diUb与靶蛋白的相互作用 | 第59-62页 |
| ·讨论 | 第62-70页 |
| ·Ub存在弱的非共价二聚相互作用 | 第62页 |
| ·Ub非共价二聚体的系综结构 | 第62-63页 |
| ·K48-diUb亚基间的非共价二聚相互作用 | 第63-65页 |
| ·K63-diUb亚基间的非共价二聚相互作用与闭合态结构 | 第65-67页 |
| ·K63-diUb的构象分布实现特异性靶蛋白的识别 | 第67-68页 |
| ·K63-diUb的不同态之间能够相互转换 | 第68-70页 |
| ·结论 | 第70-72页 |
| 3 发展刚性顺磁探针 | 第72-99页 |
| ·引言 | 第72-74页 |
| ·材料和方法 | 第74-77页 |
| ·样品制备 | 第74-76页 |
| ·蛋白质氨基酸序列 | 第74页 |
| ·人源泛素(Ub) | 第74页 |
| ·E.Coli的谷氨酰胺结合蛋白(QBP：Glutamine Binding Protein) | 第74页 |
| ·样品制备buffer | 第74页 |
| ·蛋白质的表达与纯化 | 第74-76页 |
| ·Ub的表达和纯化 | 第75页 |
| ·QBP的表达和纯化 | 第75页 |
| ·顺磁标记 | 第75-76页 |
| ·Ub24H/28H与Cu~(2+)-cap的等温滴定量热实验 | 第76页 |
| ·电子顺磁共振实验 | 第76页 |
| ·顺磁弛豫增强速率的测定 | 第76页 |
| ·holo QBP的残余偶极耦合测定以及CPMG实验 | 第76-77页 |
| ·分子动力学模拟 | 第77页 |
| ·结果 | 第77-94页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-cap的探针设计 | 第77-80页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-cap的刚性标记 | 第80-82页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-BIDA刚性探针用于Ub动态结构的研究 | 第82-85页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-NTA刚性探针用于holo QBP动态结构和功能的研究 | 第85-94页 |
| ·讨论 | 第94-97页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-cap结构单元的结合强度能够满足PRE的研究需要 | 第94页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-cap的标记策略能够实现顺磁探针的刚性标记 | 第94-95页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-BIDA刚性探针表征Ub精细的动态结构 | 第95页 |
| ·diHis-Cu~(2+)-NTA刚性探针揭示holo QBP结构的细微运动参与配体解离 | 第95-97页 |
| ·结论 | 第97-99页 |
| 4 顺磁弛豫增强用于重要蛋白质动态结构和功能研究的进一步应用 | 第99-114页 |
| ·引言 | 第99-102页 |
| ·材料和方法 | 第102-106页 |
| ·样品制备 | 第102-106页 |
| ·蛋白质氨基酸序列 | 第102-103页 |
| ·flop_LBD | 第102页 |
| ·flip_LBD | 第102-103页 |
| ·样品制备buffer | 第103-104页 |
| ·蛋白质的表达与纯化 | 第104-106页 |
| ·天然丰度样品 | 第104页 |
| ·天然丰度的顺磁标记样品 | 第104-105页 |
| ·同位素标记样品 | 第105-106页 |
| ·LBD的分析型超速离心实验 | 第106页 |
| ·LBD的三共振实验 | 第106页 |
| ·LBD分子间的顺磁弛豫增强速率测定 | 第106页 |
| ·结果 | 第106-112页 |
| ·LBD的分析型超速离心结果 | 第106-107页 |
| ·LBD主链的化学位移归属 | 第107-109页 |
| ·flop_LBD分子间的PRE实验 | 第109-112页 |
| ·讨论 | 第112-113页 |
| ·成功的样品制备方法 | 第112-113页 |
| ·GluA2的脱敏速率与LBD二聚相互作用强度相关 | 第113页 |
| ·LBD二聚体的系综结构与构象分布 | 第113页 |
| ·结论 | 第113-114页 |
| 5 总结与展望 | 第114-118页 |
| ·Ub四级结构的动态变化与功能 | 第114页 |
| ·K63-diUb四级结构的动态变化及其与靶蛋白相互作用的机制 | 第114-115页 |
| ·刚性顺磁探针标记的PRE阐述蛋白质的精细动态结构和功能 | 第115-116页 |
| ·GluA2的脱敏机制 | 第116页 |
| ·展望 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-127页 |
| 附录A：两点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_2：HSQC方式 | 第127-135页 |
| 附录B：多点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_2：HSQC方式 | 第135-140页 |
| 附录C：多点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_1：HSQC方式 | 第140-160页 |
| 附录D：两点法测量蛋白质主链~1Hn的Γ_2：TROSY方式 | 第160-164页 |
| 附录E：多点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_2：TROSY方式 | 第164-168页 |
| 附录F：两点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_2：B_HSQC方式 | 第168-171页 |
| 附录G：多点法测量蛋白质主链~1HN的Γ_2：B_HSQC方式 | 第171-174页 |
| 附录H：多点法测量蛋白质主链~(15)N的Γ_2：TROSY方式 | 第174-179页 |
| 附录I：多点法测量蛋白质主链~(13)CO的Γ_2：CON-2D-BASED C直接检测 | 第179-185页 |
| 附录J：多点法测量蛋白质主链~(13)CO的Γ_2：3D-BASED H直接检测 | 第185-190页 |
| 附录K：多点法测量蛋白质主链~(13)CO的Γ_2：HNCO-2D-BASED C直接检测 | 第190-194页 |
| 附录L：多点法测量蛋白质主链~(13)CA的Γ_2：CACO-2D-BASED C直接检测 | 第194-197页 |
| 附录M：多点法测量蛋白质主链~1HA的Γ_2：HSQC方式 | 第197-200页 |
| 附录N：顺磁探针的patch | 第200-206页 |
| 附录O：PRE约束计算蛋白质结构 | 第206-211页 |
| 英文简写索引 | 第211-215页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第215-216页 |
